1.1. ВИДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Основными объектами для оценки токсичности лекарственных средств являются экспериментальные животные: мыши, крысы, мор­ские свинки, кролики, собаки [113, 227], а также в ряде случаев и обезь­яны.

В последние годы вокруг экспериментальных работ на животных ве­дется большая полемика [199, 208]. Ставя во главу угла этические про­блемы исследования на животных, предлагается использовать альтерна­тивные методы [190, 252].

Однако изучение токсичности новых лекарственных препаратов в опытах in vitro с использованием культуры ткани, субклеточных струк­тур и других подобных тест-объектов неспособно заменить экспери­менты на целостном организме и может рассматриваться только как до­полнительное исследование. Вспомогательным является также прогно­зирование токсических параметров веществ с помощью математических методов. Таким образом, при оценке безопасности новых лекарствен­ных препаратов эксперименты на животных альтернативы не имеют. Статистические исследования разных авторов свидетельствуют о том, что процент предсказания побочных эффектов у людей на основании токсических исследований на животных достигает 70. Экстраполяция на человека данных, полученных на животных, представляет опреде­ленные трудности, но переносить на человека данные, полученные только альтернативными методами, еще более сложная задача. Безус­ловно, при работе с экспериментальными животными необходимо со­блюдать определенные правила этического характера, сформулирован­ные в соответствующих документах [25, 125, 129]. Однако следует иметь в виду, что, получая результаты токсикологического изучения лекарственных препаратов на животных, особенно патоморфологиче­ские данные, мы смело можем сказать, что здесь смерть помогает жиз­ни. Использование альтернативных методов исследования можно с ус­пехом применять при установлении механизма токсического действия препаратов или в сравнительных экспериментах с близкими по структу­ре и действию химическими веществами.

Использование физиологических, фармакологических, биохи­мических, гематологических, патоморфологических и других методов исследования в опытах на животных позволяет оценить токсические свойства препарата и с определенной долей вероятности про­гнозировать степень безопасности его применения в клинике.

Однако это сделать непросто, особенно на стадии доклинического изучения потенциального лекарственного препарата, когда метаболизм его у человека неизвестен. Видовые различия фармакокинетики и мета­болизма препаратов в организме человека и животных могут быть при­чиной их разной чувствительности к лекарственным препаратам [229, 242, 262, 265,271].

Низкий коэффициент корреляции между показателями острой ток­сичности ксенобиотиков для животных и величинами порогового пре­дела наблюдал в ряде случаев Iversen (224). Несмотря на различие меж­ду человеком и животными, на основании данных, полученных при изучении токсичности нового лекарственного средства на нескольких видах животных, можно оценить его безопасность и предсказать воз­можные побочные эффекты. Большинство исследователей отмечает, что чаще всего, особенно для изучения хронической токсичности, исполь­зуются крысы, собаки, обезьяны и морские свинки, поскольку реакции этих животных хорошо документируются. Однако не все исследователи видят необходимость использования обезьян. Так, Р1аа [256, 257] счита­ет, что при изучении общетоксического действия лекарственных средств использование обезьян следует ограничить, а при исследовании раздражающего действия использовать кроликов и морских свинок, причем автор обращает внимание на тот факт, что часто выбор модели определяется не задачей, а длительностью и стоимостью эксперимента. В некоторых случаях эффекты воздействия лекарственных препаратов совпадают у человека и обезьяны, поэтому ряд фармацевтических фирм включает обезьян (обычно макак-резусов) в число животных, на кото­рых проводят испытания токсичности лекарственных средств. Вопрос использования обезьян в лекарственной токсикологии по-прежнему ос­тается дискутируемым, поскольку показатели токсичности и побочного действия лекарственных препаратов у обезьян и человека нередко раз­личаются не только количественно, но и качественно, а стоимость таких исследований достаточно велика.

В ряде случаев можно использовать мини-свиней, учитывая близость к человеческим некоторых функций органов и систем, например, кор­тикостероидной функции надпочечников.

Интересные данные были получены Красовским Г.Н. [95]. Изуче­ние токсичности 157 химических веществ на 6 видах животных показа­ло следующее распределение животных по чувствительности.

Мыши наиболее чувствительны в 18 случаях.

Крысы 14

Морские свинки 24

Кошки 38

Кролики 28

Собаки 44

Обезьяны были чувствительнее других животных только в 1 случае из 7.

В наших исследованиях также показана различная чувствительность к лекарственным препаратам животных разных видов.

Это было четко продемонстрировано при изучении токсичности ан- тиаллергического препарата бикарфена [64]. Введение бикарфена внутрь в одной и той же дозе вызывало различные патологические из­менения во внутренних органах.

Так, у собак при применении препарата в течение 6 мес. в дозе 50 мг/кг никакой патологии выявить не удалось.

У крыс аналогичное применение бикарфена вызывало развитие па­тологических процессов во внутренних органах: в почках - белковую дистрофию, в печени - гиперплазию купферовских клеток. Обнаружен­ные изменения в большей степени были выражены у самцов.

У кроликов аналогичные изменения были выявлены после 3-ме­сячного введения бикарфена в той же дозе.

Морские свинки оказались более чувствительны к бикарфену. У жи­вотных, получавших препарат в аналогичной дозе, уже через 2 мес. от­мечалось отставание в нарастании массы тела по сравнению с кон­трольными животными. Кроме изменений в почках и печени у живот­ных этой группы были обнаружены признаки атрофии в семенниках, патологические изменения в тимусе и селезенке.

Ретроспективный анализ данных доклинического токсикологи­ческого изучения 21 противоопухолевого препарата показал, что для проведения 1-й фазы клинических испытаний достаточную инфор­мацию по токсичности можно получить в опытах на мышах и собаках [267].

Анализируя результаты наших исследований хронической токсич­ности на крысах ряда противоопухолевых препаратов - продимина, фотрина, фопурина, проспидина, спиробромина, цисплатина, - можно

сказать о полном совпадении явлений интоксикации, наблюдаемых у крыс, с побочными эффектами у человека. Причем на этом виде живот­ных можно изучать механизм развития повреждающего действия ис­следуемого вещества с помощью гистологических и гистохимических методов исследования, устанавливать дозовую зависимость, степень обратимости выявляемого эффекта после прекращения применения препарата.

Крысы удобны в работе. Можно проводить изучение состояния го­меостаза крыс с использованием различных физиологических, гемато­логических, биохимических и других методов. У крыс легче, чем у мы­шей, проводить патоморфологическое исследование внутренних орга­нов, особенно эндокринных: гипофиза, тимуса, надпочечников и др., поскольку масса этих органов даже у интактных мышей невелика, а при интоксикации часто бывает снижена. Большинство ведущих зарубеж­ных фармацевтических фирм оценку безвредности новых лекарствен­ных препаратов проводят в экспериментах на мышах и крысах (острая токсичность), крысах и собаках (подострая и хроническая токсичность).

Эти виды животных являются основными объектами при изучении общетоксического действия новых фармакологических веществ.

Относительно невысокая стоимость и простота содержания крыс по­зволяют использовать этих животных в количествах, достаточных для получения статистически достоверных результатов, и расходовать не­большое количество исследуемого вещества.

Кроме того, крысы являются одним из основных объектов при изу­чении фармакологических эффектов препаратов, что дает возможность сопоставить в адекватных условиях активность и токсичность изучае­мого вещества.

На крысах разработаны многие модели патологических состояний. Хорошо известны модели аллоксанового диабета, гепатотоксичности, пиелонефрита и др. Изучение токсичности не только на интактных жи­вотных, но и на экспериментальных моделях соответствующей патоло­гии значительно улучшает прогноз переносимости лекарственного пре­парата в клинике. Но исследования на крысах также имеют некоторые ограничения - например, отсутствие рвотного рефлекса не позволяет обнаружить на этих животных наличие таких эффектов, как тошнота и рвота. На крысах технически невозможно изучить препараты в виде таблеток, капсул и др., не нарушая

целостности лекарственной формы. Поэтому исследования токсич­ности новых потенциальных лекарственных препаратов должно быть дополнено опытами на крупных животных, например на собаках. Оп­тимальным является использование в токсикологических эксперимен­тах собак породы "бигл", которые отличаются небольшим размером и весом, малоагрессивны и болеют реже, чем их беспризорные сородичи [84].

Для определения механизма токсического действия могут быть ис­пользованы и другие виды животных. Так, при изучении механизма ад­реналовой токсичности антибактериального препарата диоксидина на­ми были использованы морские свинки, поскольку у этого вида живот­ных биосинтез кортикостероидных гормонов в коре надпочечных желез ближе к человеку, чем у других видов экспериментальных животных [55].

Вопрос о том, сколько видов экспериментальных животных не­обходимо использовать при изучении общетоксического действия ново­го вещества, продолжает обсуждаться не только в лекарственной, но и в профилактической токсикологии. По мнению одних авторов, экстрапо­ляция данных с животных на человека возможна лишь при использова­нии многих видов (до 10, включая обезьян) и линий лабораторных жи­вотных; другие авторы считают, что одинаковая реакция на исследуе­мый препарат у 3-4 видов животных обеспечивает совпадение с клини­ческими данными примерно в 70% случаев [143].

Согласно рекомендациям экспертов ВОЗ при доклинических токси­кологических исследованиях для определения острой токсичности но­вого лекарственного препарата следует использовать 2 и более видов, а изучение хронической токсичности проводить не менее чем на 2 видах, причем один из них не должен относиться к грызунам. Эти рекоменда­ции нашли отражение и в отечественных методических указаниях по доклиническому токсикологическому изучению новых лекарственных средств [113]. Вместе с тем изучение этого вопроса продолжается. Вы­сказывается мнение, в том числе и некоторыми из отечественных ис­следователей, о целесообразности изучения хронической токсичности нового препарата на тех видах животных, которые в остром опыте были наиболее чувствительны к данному веществу [106]. Однако такой под­ход не всегда оправдан, например, к большинству антибактериальных препаратов наиболее чувствительны морские свинки, однако для чело­века, как и для других видов животных, эффекты, выявленные у мор­ских свинок, не характерны.

Чувствительность животных к лекарственному средству может ме­няться и внутри вида в зависимости от линии. Вопрос использования в хронических токсикологических экспериментах нелинейных животных до настоящего времени не решен однозначно. Большинство зарубежных фармацевтических фирм проводят эти исследования на линейных жи­вотных, в частности на крысах линии Вистар. Однако работа только на

линейных животных имеет как свои достоинства, так и недостатки, по­скольку у животных чистых линий могут наблюдаться нестандартные реакции на воздействие того или иного препарата. Так, выявлены дос­товерные различия в чувствительности мышей, лишенных шерсти, и нелинейных мышей по отношению к некоторым нейроактивным лекар­ственным веществам [284]. Показано, что линейные животные в боль­шей степени подвержены инфекции. Это имеет большое значение в свя­зи с длительностью хронических токсикологических исследований. Из­бежать этих трудностей можно, работая в условиях GLP [211]. Подроб­нее эти условия будут рассмотрены в следующем разделе. Здесь хоте­лось бы только заметить, что исключать проведение токсикологических исследований на беспородных животных полностью не целесообразно, поскольку в клинике препараты будут применяться у широкого кон­тингента больных. Обязательным условием при оценке токсических свойств лекарственных препаратов является использование в экс­периментах стандартных животных. Как наиболее стандартные оце­нены инбредные животные и их гибриды первого поколения, пре­имущество которых в их большей жизнеспособности. Аутобредные жи­вотные в пределах одной популяции (питомника) также могут рассмат­риваться как стандартные. Однако генетическая структура популяции неинбредных животных из разных питомников не всегда совпадает, и это часто не обеспечивает полной воспроизводимости результатов, по­лученных в различных учреждениях [26].

Для получения надежных результатов на мелких лабораторных жи­вотных препарат должен быть изучен в нескольких дозах. На каждую дозу следует брать количество животных, достаточное для стати­стической обработки полученных результатов. Реакции самок и самцов на введение лекарственного препарата могут различаться, поэтому не­обходимо использовать оба пола экспериментальных животных.

На половые различия при оценке действия лекарственного средства указывают многочисленные авторы. В большом обзоре Goble Frans [209] рассмотрено значение полового диморфизма в проявлении эффек­тов различных групп лекарств: психотропных, местноанестезирующих и миотропных средств, сердечных гликозидов, противовоспалительных, антигистаминных, гипогликемических препаратов, антикоагулянтов, диуретиков, слабительных и противоопухолевых.

В наших исследованиях также отмечалась разная чувствительность самок и самцов крыс к одному и тому же препарату в равных условиях эксперимента. Так, было показано, что при длительном введении дик­лофенака натрия в дозах 3 и 15 мг/кг крысам обоего пола проявилась половая чувствительность к препарату. Анализ соотношения переноси­мых доз показал, что в экспериментальных условиях чувствительность самок крыс к ульцерогенному действию диклофенака натрия в 5 раз выше. Повышенная чувствительность самок к токсическому действию НПВП может быть связана с особенностями их реакций на стресс и по­вреждением органов репродукции в течение овуляторного цикла. У всех крыс самок после 6-месячного введения препарата происходило сниже­ние массы тимуса и гипертрофия надпочечников.

Половые различия в чувствительности самок и самцов к лекар­ственному препарату нередко связаны с состоянием астрального цикла у самок во время введения препарата, поэтому необходимо учитывать гормональный фон у самок при проведении изучения токсичности ле­карственных средств.

Особое значение при оценке безвредности фармакологических ве­ществ имеет возраст экспериментальных животных, на которых прово­дится исследование. На наличие четких возрастных различий функцио­нального состояния всех звеньев гипоталамо-гипофизарно- адренокортикальной системы у крыс указывает ряд исследователей. Возраст животных может влиять на экскрецию чужеродных веществ у крыс: так, у старых животных понижение диуреза приводит к сни­жению экскреции лекарственных препаратов. При проведении ток­сикологических исследований лекарственных средств, предназна­ченных для применения в детской или гериатрической практике, реко­мендуется использовать животных соответствующего возраста (см. гл. 3).

Результаты токсикологических исследований должны быть досто­верны, поэтому они подвергаются статистической обработке [144]. Рас­сматривая различные методы (ковариантный, регрессивный, многофак­торный, Стьюдента, Кохрена, Коха, Дункана, критерий Т и др.) стати­стического анализа измерений массы тела, печени и почек при хрониче­ских и подострых токсикологических исследованиях на грызунах, Weil и соавт. [286] делают вывод о равноценности методов и рекомендуют использовать наименее трудоемкие. Для некоторых целей полезную информацию можно получить из обстоятельных опытов на небольшом числе животных, особенно крупных, например, установление механиз­ма токсического действия препарата на орган-мишень.

Таким образом, количество животных в группе может быть раз­личным, однако полученные результаты должны быть достоверными, поэтому при работе с мелкими лабораторными животными их следует брать не менее 10 особей одного пола; в экспериментах на крупных жи­вотных (собаки, обезьяны) группы могут быть меньшими.

Воспроизводимые результаты могут быть получены только при

стандартном содержании экспериментальных животных