Никотиновые холинорецепторы

Никотиновый холинорецептор в отличие от мускаринового значительно быстрее реагирует на появление стимула. Он был выделен из электрических органов рыб (разд. 2.1, рис. 2.1, том 1).

связыйающим местом рецептора. Такой комплекс токсин — ре­цептор можно использовать для очистки рецептора, отделяя токсин в, конце очистки длительным диализом. В 1980 г. очи­щенный рецептор был встроен в искусственную плоскую липид­ную мембрану с целью демонстрации его пермеазной природы. С помощью дифракции рентгеновских лучей было установлено,, что рецептор пронизывает мембрану, выступая понемногу с каждой стороны. Диаметр рецептора равен приблизительно» 8,5 нм, и он включает в себя ионный канал диаметром 0,65 нм. Такой реконструированный рецептор под действием АХ увели­чивал проницаемость мембраны для катионов, причем эффект- АХ блокировался тубокурарином [Nelson et al., 1980].

Каждая рецепторная розетка (см. рис. 2.1) включает в себя пять параллельных цепочек, образующих ионный канал. На двух цепочках, называемых а-субъединицами, расположены места связывания ацетилхолина. Остальные три играют чисто структурную роль^{[7] [8].}

На выделенной из Torpedo californica иРНК, кодирующей а-субъединицу, была синтезирована и проклонирована компле­ментарная ДНК- Так была получена иРНК в количествах, до­статочных для установления нуклеотидной последовательности, по которой в свою очередь была определена первичная струк­тура а-субъединицы с ОММ 50116, содержащей 437 аминокис­лотных остатков.

Дисульфидный мостик около ацетилхолинсвязывающег» места, по-видимому, образован двумя остатками Cys-128 и 142. Что касается самого ацетилхолинсвязывающего места, то пред­полагается, что в его состав входят остатки Asp-138 (или Clu-129) и His-134.

Для возникновения физиологического ответа как минимум две молекулы АХ должны связаться с рецептором. Выброс АХ, длящийся 1 мкс, вызывает в скелетной мышце ответ про­должительностью не менее 10 мкс. Судя по этим цифрам, от­крывание ионного канала контролируется непосредственно ре­цептором и для этого не требуется предварительного фосфори­лирования. Таким образом, механизм никотинового ответа яв­ляется более простым и более прямым, чем постулированный Greenyard механизм мускаринового ответа (разд. 12.6.1).

Все приведенные выше данные получены для рецептора, выделенного из электрического органа рыб, однако сходный белок был выделен из скелетных мышц млекопитающих [Dol­ly, Barnard, 1977; Froehner, Reiness, Hall, 1977] и из коры го­ловного мозга морских свинок. Последний имеет ОММ около» 86 000, а связывание с ним [³Н]-бунгаротоксина игибируетсяі тубокурарином и галламином [Bosnian, 1972].

Более подробно о никотиновых рецепторах см. Karlin /(1980) и Conty-Tronconi, Raferty (1982).

Задолго до выделения никотинового рецептора было начато ■изучение связи структура — активность в ряду агонистов, дей­ствующих на активируемые АХ места, традиционно называемые никотиновыми. Этот термин, так же как и термин «мускарино­вый», имеет чисто историческое значение, так как никотин кли­нического применения не имеет. Известно, что никотин прояв­ляет холиномиметические свойства у позвоночных в трех струк­турах: а) на моторной концевой пластинке произвольной мышцы в нервно-мышечном соединении; б) в ганглиях симпа­тических и парасимпатических нервов и в) в коре головного мозга. Наиболее доступна для действия никотина структура t(a) (это следует хотя бы из того, что никотин является ядом для млекопитающих). Однако у насекомых, в нервно-мышечных соединениях которых не содержится АХ, основное действие ни­котина сосредоточено в ганглиях ЦНС [Yaeger, Munson, 1945]. В настоящее время никотин мало используется в качестве ин­сектицида.

Простейшее соединение, обладающее сильным никотиновым ■(но не мускариновым) действием, основной агонист — это тет- раметиламмоний-хлорид (12.77, R=Me). В ряду Н-холиноми- метиков это такое же стандартное соединение, как и метахо- дин (12.68) в ряду М-холиномиметиков.

По силе действия на автономные ганглии соли тетраметил- аммония не отличаются от АХ [Burns, Dale, 1915], однако на нервно-мышечное соединение скелетных мышц (никотино­вая активность) они действуют в сто раз слабее, чем АХ, а на ■соединение с гладкими мышцами (мускариновая активность) — в тысячу раз слабее. Взаимодействие медиатора с автономны­ми ганглиями кратковременно, а в нервно-мышечном соедине­нии этот процесс более длителен, и для него предпочтительнее молекулы, способные образовывать водородные связи, напри­мер, как АХ — за счет кето-атома кислорода. Очевидно, катион тетраметиламмония определяет биологическую активность АХ;

при необходимости длительного взаимодействия важную роль играет и остальная часть молекулы, обеспечивая дополнитель­ное связывание с рецептором.

Из соединений ряда катионов алкилтриметиламмония (ро­доначальником которого является тетраметиламмоний) макси­мальной активностью обладают соли н-пентилтриметиламмо- ния, их действие на никотиновые рецепторы такое же, как у никотина, и в восемь раз сильнее, чем у АХ [Willey, 1955].

Молекулы никотиновых агонистов, вероятно, должны нахо­диться в гош-конформации (определение см. разд. 12.3). Установ­лено, что в кристаллах и растворах большинство этих агонис­тов действительно имеют гош-конформацию (синклинальную) фрагмента —+N—С—С—О [Baker et al., 1971; Calvenor, Ham, 1966; Сапера et al., 1966]. Исключение составляет карбахолин (2.11), существующий в кристаллах в вытянутой (антипланар- ной) конформации, а в растворе — в гош-конформации [Ваг- rans, Clastre, 1970; Baker et al., 1971]. Однако данные по кон­формации агонистов, содержащих фрагменты —+N—С—С—S— и —+N—С—С—Se—, для которых вытянутая (антипланарная) конформация является преимущественной как в кристаллах [Shefter, Mautner, 1969], так и (по данным ЯМР) в растворах [Cashley, Mautner, 1970], ставят под сомнение правомерность гош-гипотезы. Например, тиохолин и S-метилтиохолин (оба в вытянутой конформации) — сильные агонисты, тогда как их кислородные аналоги холин и О-метилхолин (оба в гош-кон­формации) не активны [Mautner, Bartels, Webb, 1966]. Более того, замена карбонильного атома кислорода в молекуле АХ атомом серы не приводит к изменению гош-конформации [Ma­utner, Dexter, Low, 1972] и как сам АХ, так и ацетилтиохолин (12.87) высокоактивны в различных биологических тестах [Scott, Mautner, 1967; Mautner et al., 1966; Mautner, 1969]. Эти данные свидетельствуют о том, что, вероятно, для проявле­ния агонистической активности исходная конформация не менее

важна, чем распределение электронов.

При изучении рецепторного связывающего места был при­менен иммунологический подход, для чего были получены кроличьи антитела к фениловому эфиру холина (12.86). К со­жалению, при попытке использования этих антител в качестве модели никотинового рецептора выяснилось, что они не спо­собны различать ни вещества мускаринового и никотинового типа действия, ни агонисты и антагонисты [Marlow, Metcalf, Burgen, 1969].

Антагонисты никотиновых рецепторов. Ни один чистый ни­котиновый агонист не используется в медицине. Карбахолин (2.11) обладает не только никотиновыми, но и выраженными мускариновыми свойствами. Антихолинэстеразные лекарствен­ные вещества усиливают действие эндогенного АХ, что означа­ет одновременную активацию мускариновых и никотиновых структур. В качестве примера можно привести использование физостигмина (2.8) для лечения острой глаукомы, фосфорорга­нических соединений (разд. 13.3)—для лечения хронических случаев этого заболевания, часто встречающегося у пожилых людей, и прозерина (2.10) —для снятия нервно-мышечного блока при миастении гравис. Последний лекарственный препа­рат обладает слабым никотиновым действием и на произволь­ные мышцы.

Хотя стимуляцию никотиновых рецепторов мало используют в терапии, в хирургии широко применяют никотиновые антаго­нисты, позволяющие добиваться глубокого мышечного расслаб­ления и снижения доз общих анестетиков. В 1942 г. для этой цели был применен тубокурарин (2.6), затем в дополнение к нему появились другие четвертичные аммониевые катионы. В настоящее время известны два основных типа таких лекар­ственных веществ. Представители первого типа, например ту­бокурарин, препятствуют деполяризации мембран ацетилхо­лином, но сами не оказывают на них никакого ацетилхолино­подобного действия. Они являются, конкурентами АХ при его взаимодействии с рецептором, но не препятствуют его синтезу, высвобождению и распаду.

Таблица 12.3. Зависимость специфичности действия от длины цепи бис- триметиламмоиийных катионов на два типа холинорецепторов (антиникоти­новое действие)

Примечание. Приведены относительные активности, для каждого типа макси- мальная величина активности 1,0 [Paton, Zaimis, см. текст].

ладающие достаточно высокой ацетилхолиноподобной актив­ностью для того, чтобы вызвать деполяризацию до того, как наступит нервно-мышечный блок. Триметиламмонийные груп­пы этих соединений не испытывают стерических затруднений, поэтому возможно взаимодействие по меньшей мере одного конца молекулы с анионным местом холинорецептора, хотя вся молекула в целом достаточно велика, чтобы закрыть полость.

Сродство этих бис-ониевых солей к трем основным типам холинорецепторов отличается высокой специфичностью. Все они практически не действуют на постганглионарные рецепторы, однако их активность в ганглиях и нервно-мышечных соедине­ниях может быть исключительно высокой при условии, что для каждого из этих двух видов рецепторов выбран надлежащий гомолог. Декаметоний в дозах, в сто раз превышающих дозы, полностью блокирующие нервно-мышечное соединение, совер­шенно не действует на ганглии. Гексаметоний, наоборот, в сто­кратной дозе по сравнению с дозой, блокирующей ганглии, не действует на нервно-мышечное соединение [Paton, Zaimis, 1949, 1952]. Эта специфичность проиллюстрирована данными в табл. 12.3.

Ганглиоблокаторы типа гексаметония (7.30) вошли в меди­цинскую практику около 1950 г. в качестве препаратов для лечения гипертонии. Однако их действие на организм оказалось настолько неспецифичным, с множеством побочных эффектов, что в последствии эти препараты были вытеснены ^-адрено- блокаторами и лекарственными веществами, расслабляющими мышцы непосредственно в малых кровеносных сосудах.

Лекарственное вещество, способное связываться одновре­менно с двумя местами связывания на рецепторе, должно отли­чаться очень высоким сродством к последнему, так как: а) если один конец молекулы в результате диссоциации удаляется от поверхности, то другой конец будет ее удерживать на близком расстоянии от поверхности и тем самым способствовать реком­бинации и б) молекулы лекарственного вещества будут соеди­нены более прочно за счет ван-дер-ваальсовых сил с частью биологической поверхности, лежащей между двумя местами связывания. Введение эфирной группы в молекулы бис-ониевых

блокаторов нервно-мышечной передачи резко повышает их спо­собность ингибировать деполяризацию, как, например, холино- вые эфиры дикарбоновых кислот типа (12.88). Из этих соеди­нений в хирургии наиболее широко применяют дитилин (7.29) из-за его способности медленно гидролизоваться холинэстера­зой плазмы, что способствует прекращению действия препарата на больного после операции. (В разд. 3.5.4 упоминалось новое лекарственное вещество атракурий, гидролизующийся под дей­ствием воды.)

Усиление действия соединений типа (12.88) при введении эфирной группы указывает на наличие в рецепторе групп, спо­собных к образованию водородных связей. В ряду подобных соединений вторая триметиламмонийная группа может быть без ущерба для действия заменена атомом водорода [Danilov et al., 1974]. Замена одной триметиламмонийной группы в мо­лекуле декаметония на другую гидрофильную (например, ме­токси) группу не нарушает действие вещества и, следователь­но, для связывания никотиновых антагонистов необходима лишь одна кислотная группа в рецепторе.

О расстоянии между двумя местами связывания в холино- рецепторе можно судить по размерам молекулы панкуроний- бромида (12.89), сильного неполяризующего миорелаксанта, применяющегося в клинической практике [Baird, Reid, 1967]. Жесткость его молекулы была подтверждена спектрами ЯМР в растворе. По данным рентгеноструктурного анализа расстоя- 248

ние между двумя атомами азота в молекуле панкурония равно 1,108 нм, что сравнимо с таковым у Ь^О.О'-триметил-сІ-тубоку- рарин-дийодида в кристаллах, равным 1,07 нм (вероятно, та­ково же расстояние между атомами азота и в самом тубокура- рине). Следует отметить, что панкуроний структурно ближе АХ, чем соединения бис-ониевого тина, так как в его молекуле дважды повторяется фрагмент Me—С (О)—О—CHR—CHR— —N+R₃ [Savage et al., 1970].

Молекула декаметония (7.28) в кристаллическом состоянии полностью вытянута и атомы азота удалены друг от друга на расстояние 1,37 нм [Lonsdale, Milledge, Pant, 1965], однако в растворе это расстояние, видимо, меньше. А у молекулы дити­лина, гибкой, как и у всех деполяризующих агентов, расстоя­ние между атомами азота в кристаллическом состоянии зави­сит от аниона, образующего данную соль, и варьируется от 0,78 до 1,19 нм.

Бис-ониевые соединения, содержащие между атомами азота цепочку из 16 атомов (не обязательно углерода), обозначают N-16-N, или «С-16». Примеры таких соединений — суберилди- холин (субехолин), себацинилдихолин и карболоний-бромид (12.90), изредка применяемый в хирургии. Холинорецептор, чувствительный к соединениям «С-16», появился на ранней ста­дии эволюции и широко распространен в животном царстве. Нервно-мышечный синапс моллюсков, иглокожих и первично­хордовых ингибируется соединениями «С-16», но не «С-10»; не­которые аннелиды чувствительны к соединениям «С-10», одна­ко все черви — к соединениям «С-16». Амфибии значительно более чувствительны к «С-16»-, чем к «С-10»-ингибиторам, а высшие позвоночные примерно одинаково чувствительны к обоим типам. Из того факта, что невозможно блокировать ре­цепторы для соединений структуры «С-16», не заблокировав рецепторы для соединений структуры «С-10» (и наоборот), следует, что эти рецепторы должны иметь общие группы [Khromov-Borisov, Michelson, 1966; Михельсон, Земаль, 1970]. На основании этих данных была создана тетрамерная модель мышечного холинорецептора, согласно которой четыре анион­ных связывающих места расположены в вершинах квадрата. Соединения «С-10» взаимодействуют с двумя центрами, распо­ложенными на одной стороне квадрата (например, дитилин), а соединения «С-16» — с центрами на диагонали [Khromov- Borisov, Michelson, 1966] *.

Об истории создания и применении никотиновых антаго­нистов см. разд. 7.3.

¹ Более подробно об исследовании структуры холинорецептора химико­фармакологическими методами см. Н. В. Хромов-Борисов в ки.: Биохимическая фармакологии (под ред. П. В. Сергеева). М., Медицина, 1982. — Примеч. ред.