Ионизация рецепторов

Значения рКа рецепторов нельзя предсказать заранее, так как их химическая структура еще мало изучена. Очевидно, ка­тионные лекарственные препараты связываются с анионными рецепторами, которые могут иметь значения рКа от 2 до 7 (при наличии фосфатных групп), от 2 до 6 (карбоксильных групп) или 10 (в присутствии остатков тирозина, пиримидина, цистеи­на).

Наружные клеточные рецепторы. Далеко не все рецепторы находятся внутри клеток. Например, ацетилхолин и метилено­вый синий оказывают противоположное действие на сердце ля­гушки, не проникая в клетки [Clark, 1933], так как на наруж­ной поверхности мембраны находится множество ферментов и пермеаз. Так, на наружной поверхности дрожжей находятся аденозинтрифосфатаза и некоторые гидролазы.

Величину рКа наружного рецептора клетки во многих слу­чаях можно измерить, определяя реакцию на лекарственный препарат при различных pH, если только известно, что клетка не повреждается при изменениях pH, а степень ионизации ле­карственного вещества в этих пределах pH остается постоян­ной. О применении этого подхода к изучению места действия ан­тибактериальных аминоакридинов на Е. coli см. разд. 10.3.1.

Не всегда исследователи обращают внимание на то, что сте­пень ионизации рецептора может изменяться при изменении pH. Например, было обнаружено, что дыхание (цельных или гемолизованных) эритроцитов птиц при pH 10 в 2,5 раза силь­нее, чем при pH 5. Поскольку рК_а хинина составляет 8,4, было сделано заключение, что ингибирование вызывается действием неионизированных молекул, а не ионов. Возможность увеличе­ния степени ионизации кислотного рецептора при повышении pH (после чего он может связывать дополнительное количество катионов хинина) не была принята во внимание [Biochem. Zeitschr., 1922, 128, 169].

5,5-Дим етил оксазол идин-2,4-дион (10.38)

Б. Внутриклеточные рецепторы. Рецептор можно считать внутриклеточным, если вещества с липофильными группами бо­лее эффективны, чем не имеющие их, и если вещества, образую­щие (при pH среды эксперимента) только 70% ионной формы, более активны, чем ионизированные полностью. В этом случае изучение влияния ионизации становится более трудным, так как особенно серьезное значение приобретает pH среды, окру­жающей рецептор.

Согласно методу Waddell, Butler (1959), для определения pH внутри клетки необходимо определить три параметра: pH на­ружной среды и концентрация иона-индикатора внутри и вне клетки (клеточная мембрана при этом должна быть непрони­цаема для иона и полностью проницаема для неионизированных молекул). Авторы метода использовали бесцветный флуорес­центный индикатор 5,5-диметил-2,4-диоксооксазолидин (ДМО, 10.38), являющийся слабой кислотой (рКа 6,13 при 37 °С). С по­мощью этого метода было обнаружено, что pH внутри мышцы в состоянии покоя (у собаки) 7,04, вдыхание двуокиси углерода

понижает его до 6,6. Применяя радиоактивную форму индика­тора, Addanki, Cahill, Sotos (1967) установили, что внутри ми­тохондрии в состоянии покоя pH 7,74. Считают, что этот инди­катор для пациентов безвреден.

Другой метод определения pH внутри клетки заключается в измерении сдвига ³¹Р фосфатной группы методом ЯМР; точ­ность определения составляет ±0,02 единицы pH [Navon et al., 1977]. Применяя другой вариант этого метода, Roberts и сотр. (1980) установили, что в клетках растений pH составляет 7,1 в цитоплазме и 5,5 в вакуолях. Использованный ими метод за­ключался в определении химического сдвига пика ³¹Р в глюко- зо-6-фосфате (изменение этой величины в зависимости от зна­чений pH описывается обычной сигмоидной кривой типа кривой титрования, приведенной на рис. 10.1). Глюкозо-6-фосфат был выбран как наиболее распространенный фосфорилированный компонент клетки растений.

Существуют специальные микроэлектроды, которые вводят в живую клетку и с их помощью регистрируют изменения pH, происходящие в течение нескольких часов [Thomas, 1974].

С применением индикаторов было установлено, что pH ци­топлазмы животных и растительных клеток составляет 6,8±0,2, а эти жидкости — хорошие буферы. pH нуклеоплазмы 7,6. Внешняя поверхность органелл в том случае, если она несет отрицательный заряд (например, белковые поверхности), мо­жет содержать больше водородных ионов, чем цитоплазма вследствие эффекта дзета-потенциала. У амеб pH цитоплазмы 6,7; pH растительных вакуолей в среднем составляет 5,2, хотя у некоторых видов вакуолей эта величина значительно ниже; pH злокачественных тканей млекопитающих часто ниже, чем окружающих органов, что может быть использовано в терапии (разд. 4.2). Столь низкое значение pH злокачественных тка­ней, связанное с высокой скоростью анаэробного дыхания, тре­бует более тщательного подбора значений рКа при создании карциностатических средств типа азотистых ипритов [Ross, 1961].

Вирусы животных могут заражать организм хозяина, прони­кая в его внутриклеточные пузырьки по путям, где возможно временное понижение pH. Такие величины pH необходимы, ве­роятно, и для соответствующих конформационных изменений молекул белка [Helenius, Marsh, White, 1980].

Значения pH внутри бактериальных клеток может меняться с изменением pH буферных сред, окружающих эти клетки, что подтверждается следующим экспериментом. Тирозиндекарбок- силаза Strept. faecalis обладает максимальной активностью in vitro при pH 5,5. В интактной бактериальной клетке активность этого фермента невелика, если окружающая среда нейтральная или щелочная, однако, если поместить бактерии в буфер с pH 5,0—5,5, активность фермента сильно возрастает [Gale, 1946]. Была обнаружена линейная зависимость между pH вне- и внут- 128

риклеточной жидкости для ткани сердца черепахи в пределах 6,5—9,5 (рН_Внутр ⁼ pH внешн +2,98) [Waddell, Hardman, 1960].

При проведении фармакологических исследований желатель­но работать с буферными растворами, даже если известно, что рецептор находится внутри клетки. Наличие внешнего буфера создает однородные условия благодаря стандартизации степени ионизации лекарственного препарата, поступающего в клетку, независимо от формы его введения и состояния химических групп, ответственных за адсорбцию лекарственного вещества на поверхности клетки и за его проникновение в клетку.

Результативность применения буферов определяется коли­чеством клеток, с которыми буфер вступает в контакт. В массе культуры тканей лекарственное вещество может достичь ре­цепторов только после прохождения через другие клетки и внутриклеточную жидкость. Результаты подобных эксперимен­тов нельзя сравнивать с результатами опытов, в которых все клетки находятся в непосредственном контакте с лекарствен­ным веществом при известном pH [Simon, Beevers, 1951].

10.7.