Методы исследования

Люминолзависимую хемилюминесценцию плазмы крови, индуцированную перекисью водорода, проводили по методу В.А. Шестакова и соавт. (1979). Хемилюминесцентный анализ поводился на установке, собранной в Ростовском НИИ биологии на базе ядерного анализатора NC482B.

Определение малонового диальдегида в плазме и эритроцитах проводили колориметрическим способом (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977). Метод основан на образовании в кислой среде триметинового комплекса, состоящего из одной молекулы МДА и двух молекул 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК), который дает розовое окрашивание. Количество МДА выражали для плазмы в мкМ/л, для 1% гемолизата - в нМ/г Hb.

Активность супероксиддисмутазы(СОД) в эритроцитах определяли по методу С.С. Winterbum et al. (1975). В основе метода лежит способность к восстановлению рибофлавина под действием квантов света, которое сопровождается генерацией супероксидного анион-радикала. Последний восстанавливает тетразолий нитросиний (THC) в формазан, имеющий синефиолетовую окраску. СОД конкурирует с ловушкой за супероксид, дисмути- руя его в триплетный кислород. Активность фермента выражали в уел. ед./ г Hb.

Определение активности каталазы проводили колориметрически (Королюк М.А. и соавт., 1988). Метод основан на том, что неразложившаяся перекись водорода образует с молибдатом аммония комплекс желтого цвета. Активность каталазы в плазме, эритроцитах и лимфоцитах крови выражали в мкМ НгОг/минхл, мкМ НгОг/минхмг Hb или мкМ Н₂0₂/минхмг белка, соответственно.

Оксидазную активность иерулоплазмина определяли колориметрически (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982). Метод базируется на окислении п- фенилендиамина (n-ФДА) церулоплазмином, при котором развивается фиолетовая окраска проб, обусловленная образовавшимися продуктами, по оптической плотности которой судят о количестве церулоплазмина.

Белок определяли методом О.Н. Lowry (1951) в модификации G.R. Schachterle, R.L. Pollack (1973). Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот при их взаимодействии с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидную связь. Концентрацию белка выражали в мг на 1 мл пробы.

Определение текучести, погруженности белков в липидный бислой и полярности липидной фазы плазматических мембран спектрофлуориметри- чески проводили по методу Ю.А. Владимирова, Г.Е. Добрецова (1980).

Метод определения текучести мембран основан на способности флуоресцентного зонда пирена эксимеризоваться в неполярной среде. Текучесть липидного бислоя мембран прямо пропорциональна коэффициенту эк- симеризации пирена. В основе определения текучести в зоне белок/липидных контактов лежит способность пирена перехватывать с ароматических остатков белка энергию поглощенного света в пределах расстояния, называемого радиусом Ферстера.

Степень погружения белка в липидный бислой определяли по тушению флуоресценции ароматических аминокислотных остатков (тирозина и триптофана) в результате безизлучательного переноса энергии на молекулу пирена.

Полярность липидной фазы мембран оценивали по соотношению интенсивностей флуоресценции двух мономерных форм F₃₇₂ /F₃₉₃ в тонкой структуре спектра пирена.

Результаты выражали в условных единицах флуоресценции.

В основе определения текучести плазматических мембран методом люминесиентной микроскопии лежит тот же принцип, что описан выше. Интенсивность флуоресценции димеров (эксимеров) и мономеров в данной модификации метода определяли в отдельных лимфоцитах и эритроцитах на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ - ИЗ. В каждом препарате измеряли флуоресценцию не менее чем в 10 клетках и находили среднее значение и дисперсию среднего.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью методов вариационной статистики, используя как параметрические, так и непараметрические критерии (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973, Гублер Е.В., 1978; ЛакинГ.Ф., 1990).

Использовали параметрический t-критерий Стьюдента для оценки разности средних между двумя независимыми выборками (при сравнении показателей у онкологических больных и условно здоровых доноров) и для сравнения двух выборок с попарно связанными вариантами (при сравнении

исследуемых показателей у онкологических больных до и после проведенного лечения) (Лакин Г.Ф., 1990).

В ряде случаев при оценке изменений исследуемых показателей в процессе химиотерапии пользовались непараметрическими критериями (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973; Гублер Е.В., 1978), так как их применение предпочтительно при наличии значительных индивидуальных различий, что характерно для клинических исследований. Использовали следующие непараметрические критерии:

• критерий T (парный критерий Вилкоксона): вычисленным разностям между связанными парными наблюдениями давали ранговые номера в порядке возрастания абсолютных значений разности (без учета их знака); далее вычисляли величину Т, равную сумме ранговых номеров тех разностей, которые имели более редкий знак, то есть разностей, противоположных наблюдаемым в большинстве случаев, и сравнивали ее с приведенными в таблице максимальными значениями Т, при которых различия можно считать статистически значимыми;

• точный метод Фишера (ТМФ), который можно применять для оценки различий между распределениями, составляя общий упорядоченный ряд из значений сравниваемых выборок, для оценки качественных эффектов.

Оценивая существенность наблюдаемых различий, считали их статистически достоверными при р0,05. При р>0,1 различия считали недостоверными.