существование путей укорочения теломер при старении клеток

, так или иначе связанных с установлением в них состояния свободнорадикаль-ной пероксидации. В самом деле, от уровня свободных радикалов в культуре зависит и скорость сокращения длины теломер (Von Zglincki et al., 1995).

Можно думать также, что уже в условиях возникающего при старении умеренного окислительного стресса ряд ферментов, в том числе теломераза, попросту инактивируется по одному из указанных выше механизмов (окисление SH-групп, образование нуклеотид-белковых и S-S сшивок в теломеразе как рибонуклеопротеидном комплексе и др.). В итоге не происходит восстановления утрачиваемого в каждом митозе фрагмента теломерной ДНК. Возможно, правда, просто отключение теломеразного гена по заданной онтогенетической программе функционирования генома, осуществляющей на определённых этапах развития переключение экспрессии соответствующих генов, транскриптонов и даже целых подсистем генома (Лю, Ефимов, 1978; Лю, Саприн, 1980).

Заслуживает внимания обсуждающийся в работах Оловникова (1996) и Голубева (1996а) механизм прямого участия АФК в укорочении теломер. Поддерживается, в частности, точка зрения о том, что АФК вызывают в геноме многочисленные однонитевые разрывы (ники), в том числе и на теломерной ДНК. Эти разрывы репарируются везде, но теломерная ДНК, являясь нетранскрибируемой, репарируется хуже или вовсе не подвергается ей. Из-за этого концы нитей ДНК при репликации просто отпадают по местам разрывов (Von Zglinicki et al., 1995). Продолжая исследование, эта же авторская группа (Saretzki et al., 1999) представила следующие данные. В условиях слабого окислительного стресса теломеры человека быстрее накапливают однонитевые пов-реждения, чем промежуточные повторяющиеся участки. Индукция же окислительным стрессом указанных повреждений в теломерах фибробластов MRC-5 и клетках глиобластомы U87 сопровождается усилением экспрессии р53 и р21 и задержкой клеточного цикла. Такая ответная реакция была смоделирована и путём обработки клеток короткими однонитевыми G-богатыми фрагментами теломерной ДНК. Эти и некоторые другие результаты данного исследования означали, что задержка клеточного цикла зависима от р53 и индуцируется образованием G-богатых однонитевых фрагментов при укорачивании теломер. Причастность окислительного стресса к повреждению и укорочению теломер в данном случае очевидна.

Ускоренное укорочение теломер при воздействии окислительного стресса получило подтверждение и некоторую конкретизацию механизма ещё в одной работе (Oikawa, Kawanishi, 1999).

Немаловажно, что данный альтернативный, АФК-зависимый механизм объясняет резкие укорочения теломер, которые более соответствуют случайным событиям и в принципе невозможны, если бы действовал только обычный, «типовой» механизм постепенного сокращения длины теломерной ДНК. В этом плане вероятность АФК-индуцируемого укорочения теломер, как справедливо полагает Голубев, «тем больше, чем длиннее КРФ (концевые рестрикционные фрагменты, содержащие теломерные повторы и часть предтеломерной ДНК)», так как вероятность указанных случайных событий на длинных КРФ соответственно возрастает. Если короткие теломеры на концах деконденсированных хромосом есть показатель ограничения их связи с матриксом, то внутрихромосомные последовательности теломерной ДНК – потенциальные и повышенной вероятности места разрывов, в том числе АФК-зависимых, к которым, как отмечалось выше (см. Спитковский, 1997), они чувствительны. Интенсивность названных процессов в стареющих клетках должна, очевидно, повышаться по мере возрастания дисбаланса Δ (ПО – АО) в них, отражающего, по существу, реальный уровень внутриклеточных АФК.

Существенным аргументом, хотя и косвенным, в пользу участия АФК в укорочении теломер представляется принципиально важное, на наш взгляд, наблюдение о скорости уменьшения размера теломерных повторов в лейкоцитах периферической крови у лиц разного возраста (Frenck et al., 1998). Оказалось, что скорость потери теломер максимальна у детей в возрасте до 4 лет (более 1 т.п.н./год), затем эта скорость выходит на плато и вновь возрастает только в пожилом возрасте (более 40 лет).

Что касается данных о возрастании по мере укорочения теломер в нормальных клетках молекулярного беспорядка, рассматриваемого как эквивалент возрастных изменений (Хейфлик, 1997), то причины такой корреляции неясны. Косвенно она, возможно, и определяется невозобновляемой потерей части теломерной ДНК, затруднениями в заякоривании теломер, но более правдоподобным представляется другое объяснение. Оно исходит опять-таки из факта нарастания в стареющей клетке дисбаланса Δ (ПО – АО), индуцирования им окислительной модификации различных биомолекул, дестабилизации скоординированных в норме синтетических и регуляторных процессов одновременно и независимо от изменения длины теломер. В этой связи могут быть поняты и факты старения клеток без укорочения теломер (Mori et al., 1999 и др.) и, наоборот, отсутствия феномена ускоренного старения у мышей разного возраста с нокаутом гена теломеразы (Rudloph et al., 1999) или долгожительства смертных (незлокачественных) В-лимфобластоидных клеток, трансформированных вирусом Эпштейна-Барр и сохраняющих постоянную длину теломер без учас-тия теломеразы (Sugimoto et al., 1999). Такие данные, по мнению самого автора теломерной гипотезы (Olovnikov, 2000), требуют создания принципиально новой теории клеточного старения, включающей в себя теломерную модель лишь как особый случай.

В ряде работ теломерная гипотеза увязывается с возможной ролью в активации старения белка р53 (см. обзор: Дункан, Реддел, 1997) – ядерного фос-фопротеина, подавляющего пролиферацию клеток и известного как продукт соответствующего гена-супрессора опухолей. По мере приближения клеток к старению ДНК-связывающая способность и транскрипционная активация белка р53 действительно каким-то образом повышаются (Bond et al., 1996 и др.).

Рассмотренный выше теломерный механизм относится к стареющим и опухолевым клеткам, которые, по нашим представлениям, находятся в состо-янии непрерывно поддерживаемого кислородно-перекисного стресса на уровне, соответствующим дисбалансам ΔС (ПО – АО) и ΔК (ПО – АО) в них. Структурно-функциональные особенности указанных клеток, скорее всего, и опре-деляются перманентным действием этого внутриклеточного возмущающего фактора. Данного патологического режима нет при нормальной клеточной специализации, хотя она и имеет со старением некоторые общие проявления, наиболее очевидная из которых – полная или частичная утеря способности к пролиферации при действии внеклеточных стимулирующих сигналов. Эта осо-бенность определяется, очевидно, какими-то существенными моментами в механизме, связывающим процессы дифференцировки и пролиферации.

В норме, как известно, дифференцировка происходит по заранее предопределённой логике переключения генов и транскриптонов, причём поэтапное зак-репление появляющихся признаков специализации осуществляется при каждом клеточном цикле, перемежающимся с последовательными состояниями дифференцировки.

С изложенных позиций признаки периодичности и непрерывности пероксидативного стресса представляются нам достаточно принципиальными и, возможно, даже ключевыми для понимания некоторых противоположных эф-фектов, индуцируемых АФК (например, стимуляции дифференцировки, по одним данным, и усиления пролиферации, по другим – см. Голубев, 1996а; Пескин, 1997). Двойственность эффектов АФК определяется, вероятно, их ти-пом и соотношением, дозой и продолжительностью воздействия, при определённых сочетаниях которых могут создаваться необходимые условия как для активации окислительного митогенеза, так и для укорочения теломер, остановки деления и стимуляции дифференцировки.

Обсуждая изменения в хроматине стареющих клеток, естественно затронуть и вопрос о полиплоидизации ядер. Этот феномен, например, в печёночных клетках считают характерной особенностью процесса их старения и поэтому возможным путём оценки уровня полиплоидизации ядер судить о степени старения организма, модулируемого различными воздействиями. Для подтверждения этого положения авторы исследования (Мозжухина и др., 1997) подвергали 6-месячных крыс однократному рентгеновскому облучению в дозе 2Гр, которое вызывало структурно-функциональные изменения хроматина ядер гепатоцитов, сходные с таковыми у интактных старых животных. Через 30 сут после облучения значимо увеличивался уровень полиплоидизации всей популяции ядер. То же самое происходило и при частичной гепатэктомии, стимулировавшей клеточную пролиферацию. В обеих моделях старение клеток печени «ускорялось», и полиплоидизация их ядер признана как критерий старения, смоделированного в данных случаях искусственно. О накоплении полиплоид- ных эндотелиоцитов в нормальных сосудах в ходе онтогенеза сообщили также Ильинская и соавт. (1999). По их данным, частота встречаемости таких эндо-телиоцитов достоверно коррелирует с возрастом человека. К 35-40 годам эта частота близка к стационарному уровню, составляющему приблизительно 30% от числа всех клеток. Ярко выраженная полиплоидизация эндотелиоцитов предопределяется, вероятно, самим функциональным назначением крове-носных сосудов, которые более, чем другие органы и ткани, подвергаются систематическому «окислительному давлению».

Одной из причин патологических митозов при старении (отчасти, как и при канцерогенезе – см. п.2.3.5) предположительно может быть повреждение в соответствующих клетках тиолового механизма сборки митотического аппарата, вызванное пероксидативными условиями в них. АФК, липидные радикалы и продукты ПОЛ могут, по-видимому, непосредственно воздействовать на тиоловые группы белков и на указанный механизм, нарушая цитоскелет, сборку белков митотического аппарата в ориентированную систему веретена деления, а также деление центриолей и расхождение хромосом. В определённой степени эти нарушения могут быть связаны и с дефицитом АТР и сАМР в стареющих клетках и соответственно ослаблением зависимых от них процессов полимеризации тубулина и формирования микротрубочек веретена деления.

Наконец отметим, что комплексный и системный подходы к анализу изложенных выше материалов о возрастных изменениях в клетке представляются нам целесообразными и перспективными для понимания многих ещё неясных и достаточно существенных фактов, а также механизма старения клетки в целом. Главные же наши выводы сводятся к следующему: 1) подтверждаются известные данные о том, что прямое отношение к старению клетки имеют возраст-зависимые реорганизации как мтДНК, так и яДНК (Осивец, Хаманн, 1997; Скулачев, 1997); 2) некоторые положения теломерной теории старения и иммортализации соматических клеток могут быть в принципе осмыслены и (или) обоснованы с позиций кислородно-перекисной концепции старения и канцерогенеза; 3) при таком подходе расширяются возможности для более глубокого и полного распознавания механизмов старения и иммортализации клеток, поскольку учитывается и множество других, казалось бы, не связанных между собой внутриклеточных проявлений, индуцируемых в стареющих и опу-холевых клетках повышенным кислородно-перекисным напряжением.