1.3.2. Особого внимания заслуживает взаимосвязь процесса старения человека и разных видов животных с разнообразными делециями мтДНК.

По этой тематике опубликовано немало работ (Yen et al., 1992; Gadaleta et al., 1994; Katsumata et al., 1994; Lee et al., 1994; Miyabayashi et al., 1994; Орличенко, Литошенко, 1995 и др.).

У млекопитающих появление возрастных делеций мтДНК наиболее харак-терно для нервной и мышечной тканей (Aiken, 1995). У старых 25-месячных мышей методом ПЦР в мтДНК мозга выявлены 3 перекрывающихся делетированных фрагмента, которые затрагивали часть генов цитохромоксидазы, некоторых дегидрогеназ и тРНК (Brossas et al., 1994). Активность ферментов дыхательного комплекса 4 митохондрий из четырёхглавой мышцы бедра обезьян падала с возрастом. В частности, увеличивалось количество мышечных волокон, не дающих реакции на цитохром-с-оксидазу, причём в 89 % таких волокон имелись делеции мтДНК (Lee C. M. et al., 1998). Мелов же с соавт. (Melov et al., 1995), подтвердив увеличение в процессе старения числа делеций в мтДНК из скелетных мышц человека, отметили также, что эти перестройки гетерогенны, различаются у отдельных индивидуумов и являются общими для всех многоклеточных животных.

Наиболее частой мутацией в мтДНК из накапливающихся в течение нормального старения считается делеция 4977 п. н., которую называют «обычной делецией». Последняя происходит, кстати, и при повторяющейся обработке фибробластов человека сублетальной дозой УФ-облучения, причём данный эффект связан с образованием синглетного О2 (1О2). Обработка необлучённых клеток таким 1О2, полученным в процессе терморазложения эндопероксида, приводила к той же «обычной делеции» мтДНК (Berneburg et al., 1999).

Пробы мтДНК из скелетных мышц пациентов со старческой миопатией и здоровых доноров пожилого возраста, проанализированные методом ПЦР, под-вердили высокую частоту «обычных делеций», но в ряде случаев высокой была и частота делеций, точки разрыва которых были за пределами типичных «горячих точек» мутирования мтДНК (Shoubridge, 1995). Из этой же работы следовало, что старческая дистрофия мышц связана с интенсивным накоплением транс-криптов делетированных молекул мтДНК. В качестве примера приводятся тран-скрипты мутантного гена цитохрома в, которые уже не способны транслироваться в активный фермент. В опытах на биопсийных образцах скелетных мышц людей разного возраста выявлена прямая корреляция между структур-ной аномалией мтДНК и снижением активности комплексов дыхательной цепи митохондрий. При этом максимальное относительное содержание делетированных молекул мтДНК наблюдалось в возрасте 80 лет, что совпадало с периодом выраженного снижения активности дыхательной цепи (Lezza et al., 1994). Особенно примечательны данные сравительного анализа делеционных мутаций в митохондриях нормальных и повреждённых мышечных волокон у пожилых людей: протяжённые делеции в мтДНК обнаружены во всех 29 исследованных образцах на участках с нарушениями в системе электронного транспорта и отсутствуют на соседних нормальных участках (Cao Z.

Весьма убедительны и данные Мюллера-Хокера (Müller-Hocker, 1994) о возрастном нарушении дыхательной цепи митохондрий, связанном с уменьшением активности цитохромоксидазы в диафрагме, сердечной и глазной мышцах, в отдельных сегментах скелетных мышц и др. Показаны снижение активности субъединиц этого фермента, кодируемых в ядерном и митохондриальном геномах, накопление делеций в определённых позициях и уменьшение количества мтДНК. Исследованием мтДНК в биоптатах мышц людей в возрасте 17-89 лет с помощью той же ПЦР установлен многократный рост числа делеций с увеличением возраста, что обусловлено «накоплением оксидативных повреждений мтДНК» (Gadaleta et al., 1994). Частота делеций мтДНК у больных с предсердной фибрилляцией ассоциирована не только с этой патологией, но и с увеличением их возраста, что приводит к биоэнергетической недостаточности в миоцитах предсердий. Правда, авторы данного исследования (Tsuboi et al., 2001) считают пока неясным, являются ли делеции мтДНК причиной или следствием дефектов в систезе ATP, старения, гемодинамических нарушений и предсердной фибрилляции. Возрастную митохондриальную миопатию могут ускорять инфекционное заболевание, стресс и физическое перенапряжение (Miyabayashi et al., 1994). Интересно, что в отличие от делеций точковые мутации в мтДНК из скелетных мышц человека не накапливаются по мере старения (Palloti et al., 1996).

Делеции мтДНК имеют место и в других тканях стареющих людей. Примечательны, например, данные о возрастном снижении активности цитохромоксидазы в фибробластах. У здоровых лиц это снижение происходило быстро после 40 лет, а у 96-летнего индивида активность указанного фермента составляла всего 10 % от активности у плода. Фенотип мутантной мтДНК проявлялся лишь при преобладании его над диким типом в 3 раза (Miyabayashi et al., 1994). Число митохондриальных дефектов увеличивается с возрастом экспоненциально, причём в процессе старения они накапливаются только в постмитотических клетках. В тканях же здоровых людей в возрасте до 25 лет делеции не выявляются.

Более детальная и впечатляющая информация по данному вопросу представлена в работе Озавы (Ozawa, 1995). Подтвердив, что следствием возрастной аккумуляции мутаций мтДНК являются дефицит энергии, смерть клетки и старение организма, он, кроме того, по результатам полного секвенирования мтДНК от 48 субъектов показал: наследуемые точковые мутации мтДНК ускоряют свободнорадикальное повреждение и делеции мтДНК, приводя к образованию более 100 типов повреждённых минициркулярных молекул мтДНК, с которыми ассоциированы преждевременное старение и дегенеративные заболевания. Решающим же итогом исследования Озавы представляется выявление корреляции содержания делеционных форм мтДНК с клинической выраженностью фенотипов этих болезней и сроками жизни больных. В последующем он же (Ozawa, 1997a, 1999) детально обобщил материалы по генетическим и функ-циональным изменениям митохондрий, связанные со старением, особо обратив внимание на: действие АФК на мтДНК, её фрагментацию и точковые мутации; возникновение биоэнергетического кризиса; высвобождение апоптогенных факторов в цитоплазму; дегенерацию тканей, атрофию и старение.

Здесь к месту будет сказано, что в зависимости от значений постулируемых нами «специализированных» диапазонов дисбалансов Δ (ПО –АО) в клетках в результате дисфункции митохондрий могут устанавливаться (после «старительного» дисбаланса ΔС, с которым связано и возникновение возрастных патологий) «апоптозный» ΔА1, «канцерогенезный» ΔК, «апоптозный» ΔА2 и «цитолизный» ΔЦ дисбалансы (см.

Аналогичные материалы по делеции мтДНК представлены и рядом других исследователей (Gadaleta, 1996; Kagawa et al., 1997; Kovalenko et al., 1997; Lestienne, 1997; Melov et al., 1997; Gadaleta et al., 1998), а подробная сводка данных литературы по обсуждаемой проблеме приведена в обзоре «Возрастные изменения генома митохондрий» (Lee et al., 1997). Существенно, что такие изме-нения, будучи общими для всех живых организмов, по интенсивности их накопления отличаются в различных тканях как конкретного вида животного, так и у разных их видов. Например, количественное определение делеций мтДНК в 10 органах старых крыс показало: максимальное содержание делетированных молекул мтДНК было в печени, а наименьшее – в тонком кишечнике. В этих же органах активность SOD и GPX были соответственно самыми высокими и самыми низкими. Данный факт к тому же указывает на то, что возрастное накопление делеций мтДНК органов крысы коррелирует с оксидативным стрессом (Filser et al., 1997). По мере старения человека и крыс уровень мтДНК с делециями в мозге, печени, почках и скелетных мышцах возрастал, причём тканевое распределение делеций у обоих видов отличалось: у человека более высокой была частота делеций в мозге, печени и мышцах, а у крыс – в почках. Это означает, что старение на тканевом уровне у разных видов животных протекает по-разному (Zhang et al., 1997).

Устойчивое повышение числа делеций мтДНК наблюдалось и в процессе развития дрозофил от эмбриональной стадии до имаго, т.е. в период активного роста и метаболизма.

Обратим теперь внимание на следующий принципиальный момент. Интенсивность повреждения мтДНК различными АФК, как известно (Shigenaga et al., 1994; Пескин, 1997; Yakes, Van Houten, 1997 и др.), значительно выше, чем яДНК. Этот факт позже подтверждён ещё раз в экспериментах на клетках мыши с помощью модифицированного метода ПЦР. Более того, показана способность повреждений в мтДНК персистировать, т.е. сохраняться в ряду клеточных поколений, в то время как повреждения ядерного генома эффективно репарируются. По этим результатам авторами (Van Houten et al., 1998) сделан суще-ственный вывод: «механизм мутирования мтДНК под действием свободных кислородных радикалов с последующей персистенцией мутаций играет важную роль в накоплении аномалий мтДНК как факторе старения». Сходные в какой-то мере идеи заложены в математическую модель функционирования дефект-ных митохондрий, накопление которых признаётся главной причиной повреж-дения клеток при старении (Kowald, Kirkwood, 2000). Эта модель, учитывающая сокращение продукции ATP и уменьшение протонного градиента в повреждённых митохондриях, допускает более медленные их репликацию и деградацию, что даёт им селективное преимущество, приводя к их клональной экспансии. С нашей же точки зрения, основное «преимущество» дефектных митохондрий, по отношению к полноценным, состоит в сниженном потреблении О2, которое постоянно поддерживает в содержащих их клетках повышенные кислородно-перекисные условия, ответственные за повреждение и старение клеток.

Из сказанного выше со всей очевидностью следует, что мутации в мтДНК являются одним из главных факторов создания в клетке условий для окислительного стресса, лежащего в основе кислородно-перекисной концепции ста-рения. В этой связи представляется полезным обсудить и, по возможности, объяснить некоторые экспериментальные факты по снижению в такой ситуации чувствительности клеток к указанному стрессу. Рассмотрим, например, данные о зависимости окислительного стресса от Са2+ и действия циклоспорина А – ингибитора проницаемости пор во внутренней мембране митохон-дрий. Как оказалось, удаление Са2+ из культуральной среды полностью блокирует цитотоксическое действие окислительного стресса. Таким же эффектом обладает циклоспорин А (Wong, Cortopassi, 1997). С другой стороны, на примере тимоцитов показано, что разобщители окислительного фосфорилирования индуцируют открывание пор, через которые Са2+ быстро освобождается из митохондрий в цитозоль, а циклоспорин А чётко ингибирует этот процесс (Chernyak, 1997). Существенна также способность самого окислительного стресса стимулировать открывание пор (Halestrap et al., 1997).

Механизм реализации указанных взаимосвязанных эффектов в митохондриях пока не совсем «прозрачен». С учётом других известных фактов, наиболее привлекательной представляется следующая логика происходящих событий: 1) мутации в мтДНК, ответственные за дефектность окислительного фосфорилирования; 2) повышение уровней рО2 и ПОЛ внутренней мембраны, падение на ней мембранного потенциала; 3) образование пор на внутренней мембране; 4) выход Са2+ из матрикса через эти поры; 5) активация им фосфолипазы А2 на внешней поверхности внутренней мембраны; 6) переход митохондрий и клетки в целом в состояние умеренной окислительной цитотоксичности; 7) старение клетки по кислородно-перекисному механизму. Приведённые функционально связанные процессы позволяют понять, почему окислительный стресс, вызванный мутациями в мтДНК, зависит как от Са2+, так и действия циклоспорина А.

В норме репликация мтДНК происходит в условиях прикрепления её к внутренней мембране митохондрий (Литошенко, 1992); бόльшая часть мито-хондриальных рибосом также ассоциирована с этой мембраной (Минченко, Дударева, 1990). При избыточном ПОЛ связи мтДНК и рибосом с мембраной могут нарушаться, что должно отразиться на возможности нормальных упоря-доченных процессов репликации мтДНК и синтеза митохондриальных белков. Как известно, белки, кодируемые генами митохондрий и синтезируемые на их рибосомах, входят в состав мембран митохондрий и, следовательно, необхо-димы для образования упорядоченных мембранных ансамблей, для сборки этих функционально полноценных органелл. Между тем, при старении интенсив-ность синтеза белков митохондрий, особенно цитохромоксидазы, снижается (Eleming et al., 1985; Литошенко, 1986). Как выяснилось, возрастное падение эффективности митохондриальной трансляции может происходить и по другой причине. В оригинальных экспериментах с переносом ядер фибробластов кожи лиц разного возраста в клетки HeLa и обратного переноса ядер клеток HeLa в безъядерные фибробласты кожи людей разного возраста установлено, что снижение эффективности трансляции в митохондриях при старении обусловлено, в частности, накоплением рецессивных мутаций в ядерных генах, кодирующих факторы трансляции в митохондриях (Isobe et al., 1998).

Таким образом, сдвиги на этапе трансляции также ответственны за формирование дефектных митохондрий, снижение количественных и качественных их характеристик. С точки же зрения наследования простаренческого состояния в ряду клеточных поколений, более важным всё-таки представляется прогрессивное накопление в соматических клетках дефектов на уровне мтДНК (Hayakawa et al., 1996) и, прежде всего, тех нерепарированных мтДНК, из-за которых митохондриальное дыхание становится недостаточным, а внутриклеточный дисбаланс ∆ (ПО - АО) – повышенным. При накоплении мутаций в мтДНК нарушается скоординированная экспрессия генов, локализованных в мтДНК и ядерном геноме и кодирующих, в частности, субъединицы АТР-синтетазы, с чем должно быть связано возрастное снижение синтеза АТР (Kagawa et al., 1997). Изложенные выше соображения схематически представлены на рис. 2.

Примечательно, что важная роль повреждений мтДНК в старении и связанных с ним болезней привлекает внимание и специалистов не медико-биологического профиля, о чём свидетельствует разработка математической модели, описывающей некоторые последствия указанных повреждений (Beregovskaya, Maiboroda, 1995). Адекватно построенные модели могут быть эффективным средством углубления познаний и прогнозирования новых эффектов и закономерностей, заложенных природой в триаде «дефекты биоэнергетики – старение – возрастные патологии». Справедливости ради следует отметить, что в единичных работах взаимосвязь между возрастом и активностью дыхательной цепи митохондрий не обнаруживается (Chretien et al., 1998).