3.1 Спора и се оболочка

Наиболее хорошо изучена спора Bacillus subtilis, которую можно охарактеризовать как более или менее обезвоженный протопласт, помещенный' в слоистую оболочку (Gerhardt & Marquis, 1989).

23 Между внешней оболочкой споры и протопластом существует толстый слой

пептидогликанов, который в свою очередь можно подразделить на два подслоя: так называемый

кортекс (более толстый слой, расположенный ближе к поверхности), и тонкий слой, называемый

базовой клеточной стенкой. Слой базовой клеточной стенки по химической структуре мало

отличается от обычной клеточной стенки активной бактерии и при прорастании споры

практически не претерпевает никаких изменений (Tipper & Gauthier, 1972; Popham et al., 1996; Atrih

et al., 1996,98). Таким образом, базовая клеточная стенка сохраняет целостность клетки при

прорастании и является подложкой для нарастания обычной клеточной стенки при выходе из

. состояния споры (Atrih et al., 1996,98). Кортекс, состоящий из тех же аминосахаров и аминокислот,

что и стенка вегетирующей клетки, имеет совершенно особую структуру, похожую у многих видов

бактерий (Tipper & Gauthier, 1972; Warth & Stominger, 1972).

Клеточная стенка Б. subtitis в обычном состоянии представляет собой пептидогликан,

состоящий из остатков N-ацетил глюкозамина и N-ацетил мурамовой кислоты, соединенных [Ы-4

связями, дополненных поперечными сшивками, состоящими из три и тетрапептидон, а так же

боковыми цепями в виде трипептвдов (Warth & Stominger, 1971).

пептидогликанов кортекса стенки спор этого микроорганизма показал их существенные

структурные отличия от пептидогликанов нормальной стешш (Popham et al., 1996; Atrih et al.,

1996,98). Было выявлено, что порядка 25 % остатков мурамовой кислоты имеют боковые цепи в

виде тетрапептидов, а еще 23 % в виде L-аланина. Однако самым удивительным оказалось то, что

почти 50 % остатков мурамовой кислоты представлны в виде 5-лактама, что делает такой

пептидогликан невосприимчивым к воздействию таких мурамидаз, как лизоцим, целлозил и

некоторых других. При этом количество поперечных сшивок в пептидогликане кортекса в 10 раз

ниже, чем в обычной клеточной стенке: примерно 3 % против 30 %.

Наличие 5-лактама в структуре пептидогликана кортекса является ее наиболее характерным

отличием от таковой активно растущих клеток, но при этом сам 5-лактам не задействован в

поддержании устойчивости споры к неблагоприятным внешним воздействиям. Споры мутанта

24 cwID B. suhtilis, не имеющие S-лактама были устойчивы в обычных условиях, но теряли

способность к прорастанию (Sekiguchiet а!., 1995; Pophametal., 1996; Atrihet al., 1996,98).

Говоря о кортексе как о структуре призванной защищать спору от неблагоприятных внешних воздействий, нельзя забывать о том, что полимер кортекса должен гидролизоваться при прорастании споры, чтобы позволить проникновение воды к протопласту и дать возможность клетке перейти в новое качество (Johnstone & EHar, 19S2; Foster & Johnstone, 1990). Был обнаружен целый ряд ферментов, специфически вовлеченных в гидролиз кортекса споры во время прорастания (Hsieh & Vary, 1975; Foster & Johnstone, 1987; Makino et al., 1994; Moriyama et al,, 1996; Chen etah, 1997).

3.2 Специфические литические ферменты прорастания спор

Ферменты, о которых идет речь, получили специальное название GSLE (germination specific iytic enzymes), отражающее суть их действия, В ряде работ было показано* что 5-лактам -специфический компонент кортекса, является тем компонентом, который необходим для активности данной группы белков (Popham et al, 1996; Atrih et al., 1996,98). Подобные ферменты, нуждающиеся в 5-лактаме и неспособные гидролизовать пептидогликан обычных клеточных стенок были найдены у многих микроорганизмов; В.

Фрагменты пептидогликан а, попадающие в среду при гидролизе кортекса во время прорастания спор, указывали на действие как минимум двух типов гидролитических ферментов (Atrih et al., 199S). Одни продукты указывают на N-ацетилглкжамидазу которая разрезает гликановые тяжи кортекса, другие свидетельствуют о трапегликозилазиой активности.

Некоторое время назад GSLE белки из спор р'азличиых микроорганизмов начали описывать на молекулярном уровне. В 19S7 году Фостер и Джопстоп выделили из прорастающих спор В. megaterium фермент с молекулярной массой 29 кДа, который вызывал у спор изменения сходные с таковыми при прорастании. Анализ, проведенный при помощи антител, полученных'к этому белку, выявил его присутствие в кортексе покоящихся спор. Также в спорах других видов

25 микроорганизмов были выявлены белки, перекрестно реагирующие с этими антителами (Foster &.

Johnstone, 1988). Эксудат полностью проросших спор В. cereus IFO 13597 содержал белок с

молекулярной массой 24 кДа, вызывавший потерю поглощения в препарате спор, лишенных

внешней оболочки (Makino et al., 1994), Ген s!eB₇ кодирующий этот белок был клонирован и

секвенирован, выяснилось, что это белок, состоящий из 259 аминокислотных остатков и имеющий

сигнальную последовательность из 32 аминокислот (Moriyama et al.> 1996), в той же работе было

показано, что этот белок скорее всего является амиддзой.

Прорастающие споры Clostridium perfr'mgins S40 секретируют в культуральную жидкость два вида GSLE (Miyata et al.> 1995; Chen et ah, 1997); Первый из них - SleC, является амидазой с молекулярной массой 31 кДа, которая пековалентно присоединена к внешней стороне кортекса (Miyata et ah, 1995). Сиквенс гена данного белка выявил на его С-конце участок гомологичный нескольким пептидогликан^гидро лазам, в частности амидазе CwlL из В. subtilis (Miyata et ah» 1995)-Второй белок — SleM представляет собой мурамидазу с молекулярной массой 38 кДа, так же локализованную на внешней поверхности кортекса (Chen et ah, 1997).

При анализе полного генома В. subtilis, по гомологням с ранее известными генами других микроорганизмов, были идентифицированы три гена, кодирующие GSLE: cwti_r ykvT_r sleB, Было показано, что последний из них кодирует амилазу задействованную при пробуждении спор (Moriyama et ah, 1996). При направленной инактивации cwlJ или sleB наблюдались изменения на поздних стадиях прорастания спор В. subtilis, а мутант, нокаутированный по обоим генам, полностью терял способность к прорастанию спор (Ishikava et ah, 1998). Подобные исследования свидетельствуют о том, что для выхода из состояния споры специализированные GSLE белки совершенно необходимы и что подобный механизм характерен для различных групп микроорганизмов (Atrih & Foster, 1999).

Не исключена возможность того, что неспарулирующие бактерии способные переходить в V дормантпое состояние, тоже имегот специфические ферменты, воздействующие на их клеточную стенку при пробуждении. Возможно, пробуждающее действие Rpf на покоящиеся формы бактерий

26 связано с механизмами, подобньши тем, что описаны выше. Однако это предположение требует

экспериментальной проверки, что и явилось одной из задач данного исследования.

Пробуждение дормантных микроорганизмов имеет большое практическое значение в

медицине, так как может послужить причиной реактивации ряда инфекционных заболеваний.

Особенно актуальна эта проблема в случае активации латентного туберкулеза,