Оценка повреждающего действия химических и физических факторов

Для моделирования повреждающего действия на эндотелий различных физических и/или химических факторов использовали два вида воздействия. В первом случае культуры ЭК инкубировали в присутствии одного из окисленных производных холестерина - холестан-3р,5_а,6р-триола (далее - триол)', во втором, применяли физическое воздействие - гипертермию (+42.5°С).

Триол, приготовленный в виде концентрированного спиртового раствора (1 и 10 мг/мл) добавляли к культивируемым ЭК в концентрациях от 1 до 30 мкг/мл. Концентрация растворителя не превышала 0.1 %.

В случае гипертермии, культуры быстро нагревали до +42.5°С на водяной бане, затем переносили в отдельную камеру СОг-инкубатора, в которой поддерживалась такая же температура.

Оценку морфологических и количественных изменений проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии, анализа проницаемости клеточных мембран для радиоактивного изотопа [^5,Сг] и подсчета числа жизнеспособных клеток.

За 24 часа до начала эксперимента клеточные культуры, растущие в стандартных условиях в ячейках 24- или 48-камерных планшетов, прединкубировали с 10 мкКи/мл изотопа ^5,Сг. После нескольких отмывок от невключившейся метки средой 199 делали добавки необходимых препаратов и через определенные интервалы времени, указанные в подписях к соответствующим рисункам, отбирали аликвоты среды для определения гамма-радиоактивности.

Для построения кривых изменения числа жизнеспособных клеток, через 24- 48-72 часа культуры отмывали раствором Эрла, окрашивали 1 % раствором трипанового синего и просчитывали число ЭК с помощью гемоцитометра или видеомикроскопии, так же, как в случае построения кривых роста.

5.