1. Введение

Интракраниальная трансплантация различных видов аутологичных стволовых клеток (СК): мезенхимальных (МСК), нейральных (НСК), индуцированных плюрипотентных (iPS), обкладочных нейроэпителиальных клеток (ОНК) из обонятельной выстилки является одним из современных и активно разрабатываемых в эксперименте способов коррекции различных терапевтически резистентных нарушений центральной нервной системы (ЦНС), таких как нейродегенеративные и ишемические заболевания, травмы, послеоперационные повреждения (Honmou et al., 2011; Li et al., 2013; Cui et al., 2013; Jiang et al., 2013; Ishiai 2013; Bhasin et al., 2013; Chen et al., 2014; Balseanu et al., 2014; Chan et al., 2014; Hao et al., 2014; Kalladka, Muir, 2014; Im, Kim, 2014; Morgan, Srivastava; 2014; Tajiri et al., 2014; Alvarez et al., 2014).

Сокращения: 2ФП - двухфотонная полимеризация; МК - метакриловая кислота; МОПТМС

- метакрилоксипропил триметоксисилан; МСК - мезенхимальные стволовые клетки; НСК - нейральные стволовые клетки; ПСЛС - поверхностно-селективное лазерное спекание; ПЕГ-ДА - полиэтиленгликоль-диакрилат; ПЭДТ - поли(3,4)-этилендиокситиофен; СК - стволовые клетки; СКФ

- сверхкритические флюидные технологии; ск-СО2 - сверхкритический диоксид углерода; ЦНС - центральная нервная система; ЦПО - N-пропоксид Zr; ЭДТ - 3,4-этилендиокситиофен, iPS-индуци- рованные плюрипотентные; PCL - поликапролактон; PLA - полимолочная кислота; PLGA - сополимер полимолочной и полигликоливой кислоты.

В качестве носителя СК в экспериментальных моделях нейротрансплантации обычно используют непосредственно суспензии клеток. В то же время, показано, что максимально эффективным является применение бионосителей клеток или нейротрансплантантов, обеспечивающих быструю консолидацию разобщенных участков нервной ткани и создающих оптимальную среду для облегчения роста аксонов. Одним из таких бионосителей может рассматриваться гемостатическая губка, которая со временем рассасывается, выполнив свою функцию наполнителя.

Кроме того, материал, используемый для скаффолда, должен обладать не только большой инертностью к тканям мозга, программируемой скоростью рассасывания, но и свойством предупреждения формирования глиальных и соединительнотканных рубцов, нарушающих связи в формирующихся заново нейронных сетях мозга. В идеале такой нейроматрикс должен быть снабжен определенным набором «векторов» или факторов дифференцировки и нейротрофического действия, обеспечивающих направленное деление и развитие стволовых (или малодифференцированных) клеток. Он должен также оказывать модулирующее влияние на эндогенные нейральные стволовые клетки, которые, как известно, обладают очень ограниченным репаративным потенциалом (Li et al., 2008). Их пролиферативного ресурса хватает, как правило, для компенсации нейрональных потерь, возникающих при небольших повреждениях ЦНС, преходящих нарушениях мозгового кровообращения (транзиторные ишемические атаки, гипертонические кризы), сотрясениях и ушибах головного и спинного мозга легкой и средней степени тяжести. Однако при обширных повреждениях ЦНС их пролиферативные возможности оказываются недостаточными для компенсации неврологического дефицита и образования новых, функционально активных синаптически связанных нейронных сетей.

Известно, что главным препятствием для активной клеточной пролиферации, дифференцировки и направленного роста новообразованных волокон является группа факторов-репеллентов (сульфатированные гликозоаминопротеоглика- ны), источником которых становятся фрагменты размозженной нервной ткани и компоненты межклеточного матрикса (Schwend et al., 2012; Yi et al., 2012; Dudas, Semeniken, 2012). Поэтому одним из путей совершенствования биополимерных нейрокомпозитов считается использование компонентов, не только ингибирующих апоптоз и избыточную астроцитарно-микроглиальную реакцию, но и факторов, нейтрализующих эффекты репеллентов.

Гипотетически подобная структура способна выполнять в поврежденной нервной ткани тройственную роль - тканевого нейропротеза, вектора дифференцировки и нейропротективного агента.

В настоящее время как за рубежом, так и в России активно развиваются направления регенеративной медицины, связанные с разработкой различных биосовместимых материалов матриксов-носителей (скаффолдов), в том числе и нейроматриксов, используемых при тканевой и органной инженерии спинного и головного мозга. Разработкой и изучением свойств пригодных для трансплантации биополимерных матриксов занимаются ведущие лаборатории мира. Предложены нейроматриксы «NeuroGel» (IMITE, Швейцария); «RMx» (Total ReCord, США) и др. (Gatskiy et al., 2014; Woerly et al., 2004; Madigan et al., 2014; Kim et al., 2014; Cigonini et al., 2014). Полностью Российской разработкой является биополимерный деградируемый нейроматрикс «СфероГель-Э». В ходе его предварительных экспериментальных и клинических испытаний при травме спинного мозга было показано, что матрикс способствует более быстрому формированию нейропротезирующей ткани между пересеченными концами спинного мозга и препятствует образованию глиомезодермального рубца, ограничивающего регенерацию аксонов спинномозговых трактов (Брюховецкий и др., 2008; Астасидис и др., 2009; Федяков и др., 2009; Astacidis et al., 2011). Однако недостаточно изученными остаются механизмы, лежащие в основе его консолидирующей роли, а также возможность использования гелеобразного матрикса в качестве трансплантационной среды для прогениторных клеток мозга, способной обеспечивать их выживание и направленную дифференцировку, формирование функциональных нейронных сетей.

Создание эффективного, инертного, с программируемой биодеградацией и выделением биологически активных веществ для создания ниши носителя для нейротрансплантации будет прорывным инновационным методом для разработки новых немедикаментозных методов лечения многих заболеваний мозга, обусловленных повреждением нейронных сетей, глиальных элементов и матрикса мозга.

Нами были разработаны экспериментальные макеты материалов для нейротрансплантантов на основе полимеров с целью последующего изучения молекулярных механизмов взаимодействия материала скаффолда с популяциями аутологичных стволовых клеток, возможности создания тканеинженерной конструкции для заместительной терапии различных повреждений мозга, исследования в эксперименте отдаленных результатов воздействия нейротрансплантанта на ткань мозга.

В представленной работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику создания матриксов для нейротрансплантации с использованием метода поверхностно-селективного лазерного спекания (ПСЛС), двухфотонной полимеризации (2ФП) и сверхкритических флюидных технологий (СКФ), обладающих определенной геометрией, скоростью рассасывания матрикса, соответствующей скорости роста аксонов и дендритов, и формирования нейронных сетей в поврежденном участке мозга, программируемого для выделения биологически активных веществ (антиоксидантов, факторов роста, нейротрофических факторов) с целью поддержания определенной ниши в имплантируемом участке мозга;

2. Изучить токсические свойства матриксов при культивировании на них клеток мозга и выявить биосовместимость материала матрикса in vitro с использованием широкопольной и лазерной флуоресцентной конфокальной микроскопии.