Исследование структуры и флуоресценции одиночной липофусциновой гранулы

Используя метод микроскопии ближнего поля, нами было исследовано распределение флуоресценции в одиночных ЛГ (Петрухин и др., 2005). На рис. 4А показан профиль высоты единичной гранулы и отмечены шесть точек, в которых производилась регистрация спектров флуоресценции.

В этих же опытах было продемонстрировано обесцвечивание флуорофоров при действии на ЛГ видимого света. На рис. 4Б показано падение интенсивности флуоресценции при длительном облучении скоплений ЛГ зеленым светом (длина волны 532 нм). Возбуждение осуществлялось через зонд микроскопа ближнего поля. Спектры флуоресценции регистрировали после непрерывного облучения нарастающими дозами: от 0 до 24-10⁹ Дж/см². Как видно из рисунка, с увеличением дозы интенсивность флуоресценции значительно падает. Более того, происходит некоторое изменение формы спектра флуоресценции. Эти данные свидетельствуют о том, что под действием излучения на длине волны 532 нм в ЛГ происходит обесцвечивание флуорофоров, в результате чего образуются продукты фотоокисления, поглощающие свет в спектральной области короче 420 нм (Яковлева и др., 2009). Согласно электронно-микроскопическим данным, ЛГ гомогенна (Schraermeyer et al., 1999). Однако данные атомно-силовой микроскопии указывают на то, что гранула состоит из более мелких агрегированных частиц.

Таким образом, и микроскопия ближнего поля, и атомно-силовая микроскопия свидетельствуют о неоднородной структуре ЛГ. Дальнейшие ультраструктурные, фото- и биохимические исследования необходимы для понимания процесса биогенеза ЛГ в клетках РПЭ в норме и, особенно, при патологии.

Как известно, при возбуждении синим светом ЛГ сильно флуоресцируют в желтой области спектра (А,_мякг~600 нм) (Delori et al., 1995). Считается, что за эту флуоресценцию ответственен в основном A2E и/или изо-А2Е (Ben-Shabat et al., 2002b; Schmitz-Valckenberg et al., 2002). Помимо А2Е в ЛГ присутствуют еще несколько флуорофоров, поглощающих в синей области спектра. В наших экспериментах четко проявилась неоднородность флуоресценции ЛГ. Более того, далеко не все гранулы при возбуждении 410 нм флуоресцировали. Оказалось, что даже во флуоресцирующей грануле флуоресценция регистрировалась только в отдельных ее областях. Также было показано, что при длительном облучении видимым светом (длина волны 532 нм) флуоресценция ЛГ существенно падает. Это может означать, что флуорофор (или флуорофоры), поглощающий свет в области 410 нм, разрушается и переходит в продукты, поглощающие в более коротковолновой области спектра. Изменение формы спектра может быть обусловлено наличием или появлением в ЛГ других, отличных от А2Е, флуорофоров. Что касается обесцвечивания флуорофоров ЛГ и образования коротковолновых продуктов фотоокисления,

Рис. 4. (А) Топография единичной ЛГ, полученная при помощи микроскопа ближнего поля Отмечены точки, в которых производилась регистрация спектров флуоресценции, и показаны соответствующие спектры флуоресценции. (Б) Спад интенсивности флуоресценции при длительном облучении ЛГ на длине волны 532 нм (Петрухин и др., 2005)

то действительно, in vitro при облучении А2Е синим светом показано появление его эпокси-форм. Основные продукты фотоокисления - это 7,8,7',8'-бис-эпоксид и относительно стабильный оксид 5-8 5’-8’-бис фураноида (Ben-Shabat et al., 2002а; Dillon et al., 2004; Яковлева и др., 2006). Повышенный синтез А2Е и его переход при действии света в продукты окисления - эпоксиды, были показаны и в опытах in vivo - в сетчатке и РПЭ нокаутных мышей (abcr^-), для которых характерно накопление избытка ЛГ в клетках РПЭ (Radu et al., 2004). Более того, продукт окисления А2Е (моно-эпоксид А2Е) обнаружен в ЛГ РПЭ глаза человека (Avalle et al., 2004). Обесцвечивание ЛГ и образование фотоокисленных продуктов может объяснять феномен усугубляющего действия света при развитии дегенеративных заболеваний сетчатки.

5.2.