Механизмы нарушения барьерной функции биологических мембран

Повреждение компонентов биологических мембран при пато­логических процессах. Биологические мембраны наряду с элемента­ми цитоскелета формируют ультраструктуру протоплазмы. Кроме того, они выполняют множество функций, нарушение любой из которых может привести к изменению жизнедеятельности клетки в целом и даже к ее ги­бели.

Наиболее тяжелые последствия вызывает повреждение липидного слоя мембран (рис. 2.5, 7), называемого также липидным бислоем, так как он образован двумя слоями липидных молекул (рис. 2.5, 2). Липид­ный бислой клеточной и внутриклеточных мембран выполняет две основ­ные функции — барьерную и матричную (структурную). В нормально фун­кционирующей клетке срединная часть липидного бислоя представляет собой сплошную пленку, образованную углеводородными «хвостами» фосфолипидных молекул. Эта пленка, по свойствам близкая к расплав­ленному парафину, практически непроницаема для ионов и молекул во-

Рис. 2.5. Общая схема строения биологических мембран. Объяснения в тексте.

дорастворимых веществ, таких, как углеводы, аминокислоты, белки, нук­леотиды и нуклеиновые кислоты. Повреждение этого сплошного барьера приводит к нарушению регуляции внутриклеточных процессов и тяжелым расстройствам клеточных функций.

В то же время липидный слой мембран формирует в клетке особую жидкую фазу. На поверхности раздела водной и ли­пидной фаз, а также внутри липидной фазы «плавают» мно­гочисленные ферменты, многие субстраты биохимических реакций, белковые клеточные рецепторы, гликолипиды и гликолипопротеиды, образующие гликокаликс.

Во многих клетках до 80 % белков встроены в мембраны или связа­ны с их поверхностью (рис.

Для наружных клеточных мембран характерно наличие гликокалик­са, образованного гликолипидами и гликопротеидами (рис. 2.5, 3 и 2.5, 4). Гликокаликс выполняет ряд функций, вчастности, от него зависят свой­ства клеточной поверхности, способность клеток к фагоцитозу и адгезии с другими клетками. Гликокаликс эритроцитов препятствует их агглюти­нации. Повреждение гликокаликса приводит к тяжелым последствиям, помимо прочего еще и потому, что это вызывает изменения иммунных свойств клеточной поверхности.

Действие многих токсичных соединений направлено на белковые компоненты клеточной мембраны. Например, цианистый калий блокиру­ет цитохромоксидазу — фермент, входящий в состав внутренних мемб­ран митохондрии. Ионы тяжелых металлов (ртуть, серебро, свинец) свя­зывают SH-группы белков, в том числе мембранных ферментов и ионных каналов (рис. 2.5, 7 и 2.5, 8), вызывая их инактивацию. На белки плазма­тических мембран или элементы цитоскелета (рис. 2.5, 5 и 2.5, 6) направ­лено действие многих бактериальных токсинов. Изменения активности мембранных ферментов, каналов и рецепторных белков, вызванные не­благоприятными факторами, также приводят к нарушению функции кле­ток и развитию заболеваний.

Основные механизмы нарушения барьерных свойств липидно­го слоя. Изучение воздействия разного рода повреждающих агентов на изолированные клетки (например, на эритроциты), митохондрии, фосфо­липидные везикулы (липосомы), плоские бислойные липидные мембра­ны (БЛМ) и другие модельные объекты показало, что в конечном счете существует четыре основных процесса, которые при патологии непосред­ственно обусловливают нарушение целостного липидного бислоя [Вла­димиров Ю.А., 1973]:

— перекисное окисление липидов;

— действие мембранных фосфолипаз;

— механическое (осмотическое) растяжение мембраны;

— адсорбция на бислое полиэлектролитов, включая некоторые белки и пептиды.

Чтобы понять роль этих процессов в развитии патологического со­стояния, надо знать химические и физические условия протекания каж­дого из них, пути их регуляции в живой клетке и причины ее нарушения, характер повреждения свойств мембран под действием данного процес­са, биологические последствия такого повреждения мембран для жизне­деятельности клетки и организма в целом. Рассмотрим эти вопросы на примере наиболее изученного процесса — перекисного окисления (пе­роксидации) липидов.

Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов. Пере­кисное окисление (пероксидация) липидов — пример процесса, идуще­го с участием свободных радикалов. Свободные радикалы — это молеку­лярные частицы, имеющие непарный электрон на внешней орбитали и обладающие высокой реакционной способностью. Их изучение ведется методом ЭПР (спиновые ловушки), хемилюминесценции и путем приме­нения ингибиторов реакций, в которых участвуют радикалы определен­ного типа.

В табл. 2.3 приведен перечень основных типов свободных радика­лов, образующихся в организме человека.

Свободные радикалы, образующиеся в клетках организма

Первичные радикалы. К первичным можно отнести радикалы, об­разующиеся в клетках ферментативным путем, — это радикалы кислоро­да (супероксид и гидроксильный радикал), монооксид азота, радикалы, образующиеся в окислительно-восстановительных реакциях (например, убихинол). Вторичные радикалы образуются при неферментативных ре­акциях ионов железа. Это гидроксил-ради калы и радикалы липидов. Ра­дикалы образуются также при действии ультрафиолетовых лучей и входе метаболизма некоторых чужеродных соединений (ксенобиотиков), в том числе некоторых препаратов, ранее применявшихся в качестве лекарств.

Активные формы кислорода. Основная масса молекулярного кис­лорода, потребляемого клетками нашего организма, непосредственно восстанавливается до воды, окисляя органические субстраты в цепях пе­реноса электронов.

НАДФН + 2О₂ -gt; НАД⁺ + Н⁺ + 2О₂“ (супероксид).

Дальнейшая судьба супероксидных радикалов может быть разной (см. рис. 2.6). В норме и при отсутствие ионов металлов переменной ва-

Рис. 2.6. Метаболизм супероксидного радикала. Объяснения в тексте.

лентности супероксидные радикалы превращаются в перекись водоро­да; эта реакция катализируется ферментом супероксиддисмутазой (ре­акция 2):

Клетки-фагоциты используют перекись водорода, превращая ее в гипохлорит — соединение, разрушающее стенки бактериальных клеток; эта реакция катализируется ферментом миелопероксидазой (реакция 3):

Избыток перекиси водорода удаляется под действием двух фермен­тов: глутатион-пероксидазы или каталазы (4 на рис. 2.6):

Н₂О₂ + 2GSH (глутатион) Глутатионпероксидаза 2Н₂О + GSSG;

Радикал гидроксила. В условиях патологии могут произойти нару­шения либо системы защитных ферментов (в частности, снижение актив­ности СОД), либо ферментных систем, связывающих ионы железа в плаз­ме крови (церулоплазмин и трансферрин) и в клетках (ферритин). В этом случае супероксидные радикалы и перекись водорода вступают в альтер­нативные реакции:

1. образование двухвалентного железа из трехвалентного (рис.

2.реакция перекиси водорода и гипохлорита с ионами двухвалентно­го железа (рис. 2.6, 9 и 70):

Совокупность продуктов, образуемых активированными клетками- фагоцитами (радикалы супероксида и гидроксила, перекись водорода и гипохлорит), называют активными формами кислорода¹, некоторые авто­ры называют гипохлорит и продукты его метаболизма в тканях (такие, как хлорамины R-NHCI), активными формами хлора.

Радикалы гидроксила химически исключительно активны и вызыва­ют повреждение белков, нуклеиновых кислот и липидов биологических мембран. Особенно тяжелые последствия имеют две последние реакции. Радикалы «ОН вызывают разрыв нитей ДНК, оказывают в зависимости от ситуации, мутагенное, канцерогенное или цитостатическое действие. Вместе с тем, реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входя­щими в состав мембранных липидов, радикалы гидроксила инициируют цепную реакцию их пероксидации (перекисного окисления).

Цепное окисление липидов. Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии. Она протекает в не­сколько стадий, которые получили название инициирование, продолже­ние, разветвление и обрыв цепи (рис. 2.7). Рассмотрим эти стадии под­

робнее

Рис. 2.7. Реакция цепного окисления липидов.

А — реакция с неразветвленной цепью, Б — разветвленная цепная реакция

Инициирование цепи. Радикал гидроксила — небольшая по разме­ру незаряженная частица — способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасы- щенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), вхо­дящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы кро­ви. При этом в липидном слое мембран образуются липидные радикалы:

НО- + LH -gt; Н₂О + L-.

Липидный радикал (L*) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом; при этом образуется новый свободный ра­дикал — радикал липоперекиси (LOO):

Продолжение цепи.

Чередование двух последних реакций представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов (см. рис. 2.7, А).

Разветвление цепи. Существенное ускорение пероксидации ли­пидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвален­тного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результа­те взаимодействия Fe²⁺ с гидроперекисями липидов:

Образующиеся радикалы LO* инициируют новые цепи окисления липидов (рис. 2.7, Б):

Обрыв цепей. В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результа­те взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (1пН), иона­ми металлов переменной валентности (например, теми же Fe²⁺) или друг с другом:

Использование хемилюминесценции для изучения реакций, идущих с участием свободных радикалов. Последняя реакция интерес­на еще и тем, что она сопровождается свечением — хемилюминесценци­ей. Интенсивность хемилюминесценции очень мала, поэтому ее иногда называют «сверхслабым свечением». Интенсивность свечения пропорци­ональна квадрату концентрации свободных радикалов в мембранах, а ско­рость перекисного окисления прямо пропорциональна концентрации тех же радикалов. Поэтому интенсивность «сверхслабого» свечения однознач­но отражает скорость липидной пероксидации в изучаемом биологичес­ком материале, и измерение хемилюминесценции довольно часто исполь­зуется при изучении перекисного окисления липидов в различных объектах.

Измерение хемилюминесценции широко применяется также для изучения образования активных форм кислорода клетками крови и пери­тонеальными макрофагами. В присутствии специальных соединений — люминола и люцигенина — наблюдается хемилюминесценция изолиро­ванных лейкоцитов крови, макрофагов или разведенной цельной крови, если клетки-фагоциты продуцируют гипохлорит, и радикалы кислорода (супероксид + гидроксил-радикал). Интенсивность хемилюминесцентных

ответов клеток увеличивается в несколько раз при появлении очагов не­кроза в организме, например после инфаркта миокарда, и, напротив, уг­нетается при тканевой гипоксии; поэтому измерение клеточной хемилю­минесценции может быть использовано в ряде случаев с целью выявления заболевания, оценки тяжести состояния больного и эффективности на­значенного лечения.

Биологические последствия пероксидации липидов. Увеличен­ное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов (которое иногда называют оксидативным стрессом) сопровождается рядом нарушений в свой­ствах биологических мембран и функционировании клеток. Наиболее изу­чены три прямых следствия перекисного окисления липидов.

Во-первых, перекисное окисление липидов сопровождается окис­лением тиоловых(сульфгидрильных) групп мембранных белков (Рг). Это может происходить в результате неферментативной реакции SH-групп со свободными радикалами липидов; при этом образуются сульфгидриль- ные радикалы, которые затем взаимодействуют с.образованием дисуль­фидов либо окисляются кислородом с образованием производных суль­фоновой кислоты:

г

Связанные с перекисным окислением липидов окисление белков и образование белковых агрегатов в хрусталике глаза заканчиваются его помутнением; этот процесс имеет большое занчение в развитии старчес­кой и других видов катаракты у человека. Важную роль в патологии клетки играеттакже инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы, в первую очередь Са²⁺—АТФазы. Инак­тивация этого фермента вызывает замедление «откачивания» ионов каль­ция из клетки и, наоборот, вход кальция в клетку (рис. 2.8, 1), увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждение клетки.

Рис. 2.8. Нарушение барьерных свойств мембран при перекисном окислении липидов.

Наконец, окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через такие дефекты в клетки входят ионы натрия, а в митохондрий — ионы калия. В результате увеличивается осмотическое давление внутри клеток и митохондрий, что способствует еще большему повреждению мембран.

Во-вторых, результат перекисного окисления липидов связан с тем, что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Показано, что продукты перекисного окисления липидов делают липидную фазу мемб­ран проницаемой для ионов водорода (рис. 2.8,2) и кальция (рис. 2.8, 3).

Это приводит к тому, что в митохондриях окисление и фосфорилирова­ние разобщаются, а клетка оказывается в условиях энергетического го­лода (т.е. недостатка АТФ). Одновременно в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры.

Третьий (и быть может, самый важный) результат пероксидации — это уменьшение стабильности липидного слоя, что может вызвать элект­рический пробой мембраны собственным мембранным потенциалом, т.е. под действием разности электрических потенциалов, существующей на і мембранах живой клетки. Электрический пробой приводит к полной по- ' тере мембраной ее барьерных функций (рис. 2.8, 4).

Клеточные системы антирадикальной защиты. В нормальных условиях процесс перекисного окисления липидов находится под стро­гим контролем ферментативных и неферментативных систем клетки, от­чего скорость его невелика. Принято делить химические соединения и физические воздействия, влияющие на скорость перекисного окисления липидов, на прооксиданты (усиливают процессы перекисного окисления) и антиоксиданты (тормозят перекисное окисление липидов). К проокси­дантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (на­пример, при длительной гипербарической оксигенации больного), фер­ментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа.

Хотя сам процесс перекисного окисления развивается в виде цеп­ных реакций в липидной фазе мембран и липопротеинов, начальные (а возможно, и промежуточные) стадии этой сложной системы реакций про­текают в водной фазе. Часть защитных систем клетки также локализуется в липидной, а часть — в водной фазах. В зависимости от этого можно го­ворить о водорастворимых и гидрофобных антиоксидантах.

Антиоксиданты водной фазы. Основные реакции в водной фазе, предшествующие цепному окислению, и роль антиоксидантов в ограни­чении скорости этих процессов можно представить в виде схемы:

Непосредственными предшественниками гидроксильного радика­ла, инициирующего цепное окисление липидов, служат ионы двухвалент­ного железа и перекись водорода (или образующийся из нее гипохлорит). По этой причине образование радикала гидроксила и пероксидация ли­пидов тормозятся веществами, снижающими концентрацию одного из этих двух соединений. К ним относятся следующие вещества:

— фермент супероксиддисмутаза — снижает концентрацию суперок­сидных радикалов и тем самым препятствует восстановлению ими ионов трехвалентного железа до двухвалентного. В клетке ионы же­леза хранятся в трехвалентном состоянии в специальных депо, об­разованных субъединицами белка — ферритина;

— ферменты каталаза и глутатионпероксидаза — удаляютперекись во­дорода. Эффективность работы глутатионпероксидазы зависит от концентрации свободного глутатиона, при снижении которой может возрастать концентрация цитотоксических гидроксильных ради­калов;

— регенерация восстановленного глутатиона (GSH) из окисленного (GSSG) осуществляется за счет НАДФН; этот процесс катализиру­ется ферментом глутатион редуктазой. Недостаток глутатиона в клет­ках, например в эритроцитах, который может быть обусловлен дей­ствием токсичных веществ, например ионов тяжелых металлов или наследственным недостатком глутатионредуктазы, приводит к ак­тивации перекисного окисления; это, в частности, наблюдается при некоторых видах гемолитических анемий;

— соединения, связывающие ионы железа (комплексоны). Следует, однако, добавить, что в водной фазе некоторые комплексы ионов железа вступают в реакции с супероксидным радикалом и перекисью водорода наряду со свободными ионами железа.

Антиоксиданты, тормозящие развитие цепных реакций в ли­пидной фазе. Основные реакции в липидной фазе биологических мемб­ран и липопротеинов крови, а также роль антиоксидантов в ограничении скорости этих процессов можно продемонстрировать с помощью схемы.

Цепные реакции «ведут» свободные радикалы липидов (L* и LOO), разветвление цепей происходит при взаимодействии продукта перокси­дации — гидроперекиси липидов (LOOH) с ионами Fe²⁺. Все соединения, снижающие концентрацию перечисленных веществ, выполняют функцию антиоксидантов. К ним относятся:

— ферменты фосфолипаза и глутатионпероксидаза, разрушающие гидроперекиси липидов, предотвращая разветвление цепей окис­ления’липидов в мембранах. При этом действие фосфолипазы зак­лючается в отщеплении от фосфолипидов окисленной жирной кис­лоты, содержащей гидроперекисную группу (LOOH), а действие глутатионпероксидазы сводится к восстановлению этой группы до спиртовой с одновременным окислением глутатиона (GSH) до ди­сульфида (GSSG):

— ловушки радикалов, которые называют иногда «липидными анти­оксидантами». По своей химической природе липидные антиок­сиданты — это производные фенола. К ним относится а-токоферол (витамин Е), убихинон (кофермент Q), тироксин, эстрогены и синте­тические соединения, например ионол;

— соединения, связывающие железо. Большинство из них, включая такие природные соединения, как дипептид карнозин, не просто связывают железо, но, главное, не дают ему возможности приник­нуть в липидную фазу мембран, поскольку образующиеся комплек­сы в силу своей полярности не проникают в гидрофобную зону.

Для детоксикации двухвалентного железа в организме существует, по-видимому, целая система окисления и связывания ионов железа. В плазме крови эта система представлена ферментом церрулоплазмином (феррооксидазой), который окисляет Fe²⁺ до Fe³⁺ кислородом без обра­зования свободных радикалов, и белком трансферрином, который свя­зывает и переносит в кровяном русле ионы трехвалентного железа, а за­тем захватывается клетками. В клетках железо может восстанавливаться аскорбиновой кислотой и другими восстановителями, но затем окисля­ется и депонируется в окисленной форме внутри ферментного белкового комплекса ферритина.

2.1.4.