А. Механизм действия метотрексата.

Метотрексат ингиби­рует ДГФР, выделенную из клеток млекопитающих и бактерий,

несмотря на то, что обычно он не проникает в бактериальные клетки [Nichol, Welch, 1950; Werkheiser, 1953].

Дигидрофолатредуктазы разных типов могут катализировать восстановление как фолата, так и дигидрофолата, хотя дигидро­фолат реагирует с ферментами позвоночных в 4-—10 раз быст­рее, чем фолат. Скорость восстановления фолата бактериаль­ными ферментами очень незначительна [Blakley, 1969].

Рентгеноструктурный анализ дигидрофолатредуктазы (ДГФР), закристаллизованной с метотрексатом, позволил глуб­же понять механизм действия этого ингибитора и наглядно представить взаимодействие лекарственного вещества с рецеп­тором [Matthews et al., 1977], позднее Bolin и сотр. (1982) ис­пользовали прибор с разрешением до 0,17 нм. Диаграмма фермента ДГФР, его кофермента (NADPH) и метотрексата представлена на рис. 9.4. Изображенный на нем фермент полу­чен из бактерий Lactobacillus casei и те же авторы сообщили о ДГФР (закристаллизованной с метотрексатом), извлеченной из бактерий Е.

Метотрексат связывается с ферментом, полученным из L. ca­sei, следующим образом. Анион Asp-26 фермента связан с ка­тионом амидиния, образованным из атомов N-1 и 2-NH₂ лекар­ственного вещества (значения рК_а приведены в колонке N-1 табл. 9.3). Аминогруппы, связанные с атомом С-4 лекарственно­го вещества, образуют водородную связь с карбонильными груп­пами Leu-4 и А1а-97. а-Дарбоксильная группа глутаминового фермента метотрексата образует ионную связь с основной боко­вой цепью Arg-57. Птеридиновое кольцо проникает в полость, ограниченную Leu-4, Ala-6, Leu-27, Phe-ЗО и А1а-97.

пара-Аминобензоильный фрагмент располагается в соседней полости, окруженной липофильными боковыми цепями Leu-27 и Phe-ЗО, с одной стороны, и Phe-49, Pro-50 и Leu-54 — с другой.

Молекула кофермента НАДФН полностью вытянута; никоти- намидная часть располагается напротив птеридинового кольца 38

Рис. 9.4. Стереодиаграмма птеридинсвязывающего участка днгвдрофолатрс- дуктазы L. casei. Ингибитор метотрексат выделен жирными линиями, бе­лок — светлыми, молекула НАДФ (показана только ее часть) — пунктиром; атомы углерода изображены небольшими, а атомы кислорода — большими светлыми кружками, атомы азота — черными кружками; цифры в кружках — связанные молекулы воды [Bolin et al., 1982].

в положении, облегчающем перенос гидрид-иона от пиридино­вого цикла к атому углерода в положении 6 птеридинового кольца [Filman et al., 1982].

Диаграмма для фермента, полученного из бактерий Е. coli, практически идентична представленной на рис. 9.4 [Bolin et al., 1982].

Отличительной особенностью метотрексата является то, что при связывании с ферментом птеридиновые ферменты антиме­таболита и природного субстрата ориентированы противопо­ложно. В отличие от метотрексата (см.

Полагают, что главная причина различной ориентации мето­трексата и субстрата при связывании с ферментом заключается в разных положениях и основности наиболее основного атома азота в молекуле (см. табл. 9.3). Метотрексат почти в сто раз более сильное основание, чем дигидрофолиевая кислота, благо-

Таблица 9.3. Величины рКа фолиевой кислоты и ее производных (вводе), полученные: А — с помощью спектрофотометрии, В — с помощью ЯМР-образ- цов, обогащенных ¹³С по атому С-2 [Рое, 1977; Cocco et al., 1981]

даря замене циклической амидной группы (CO-4/NH-3) амино­группой. Следует отметить, что наиболее основным центром метотрексата является амидиновая группа N’ = C²—NH2, нахо­дящаяся в сопряжении, в то время как наиболее основный центр в молекуле дигидрофолиевой кислоты расположен в другом цикле птеридинового ядра и не соприкасается с каким-либо противоположно заряженным центром молекулы фермента.

Наиболее основный центр молекулы метотрексата имеет рКа 5,71 и, следовательно, только 2% его будут существовать в виде катиона при pH 7,3 в воде (табл. 17.1). Поэтому если даже предположить, что молекула метотрексата образует лишь одну ион-дипольную связь с молекулой аспарагиновой кислоты, то и этого было бы достаточно для того, чтобы обеспечить большое конкурентное преимущество метотрексата по сравне­нию с дигидрофолиевой кислотой.