Биохимические различия, способствующие избирательности

Любую биологическую систему можно рассматривать как арену постоянной борьбы за следовые количества/катионов тя­желых металлов. При поражении позвоночных/микроорганиз- мами в организме-хозяине быстро понижается /уровень железа и цинка в плазме.

Аналогичные явления отмечают у онкологических больных, у которых понижается уровень содержания железа в плазме [Konaka, Matsuoka, 1967] и повышается концентрация меди [Mortazani et al., 1972]. Иногда из-за наличия злокачественной опухоли понижается концентрация цинка в плазме [Davies, Musa, Dormandy, 1968], что, по-видимому, является реакцией организма, так как у многих животных наблюдали ингибиро­вание роста опухоли при исключении из рациона цинка [De Wys, Pories, 1972].

С помощью каких же веществ происходит связывание катио­нов тяжелых металлов в живых клетках? Следует отметить, что таких веществ великое множество, но в первую очередь внимания заслуживают аминокислоты. Большинство аминокис­лот, входящих в состав белков, имеет примерно такие же кон­станты связывания, как глицин (11.1). Необычно высокой спо­собностью связывать металлы обладают две аминокислоты: гистидин (11.2) благодаря наличию в его молекуле имидазоль­ного кольца и цистеин (11.3) за счет тиольной группы [Albert, 1952]. К этим двум примерам можно добавить цистин — эф­фективный, специфически действующий агент, способный связы­вать медь [Hawkins, Perrin, 1963]. В настоящее время очевид­но, что белки связывают металлы в основном с помощью гис- тидиновых и цистеиновых остатков.

Компьютерный анализ результатов потенциометрического изучения 160 равновесных взаимодействий между Cu²+, Zn²⁺ и 17 аминокислотами (все присутствовали одновременно) пока­зал, что 85% меди образует комплекс гистидин—медь—цис-

теинв соотношении 1:1:1 и 67% цинка связано с цистеином и гистиіціном [Hallman, Perrin, Watt, 1971].

В кровотоке аминокислоты связаны с очень незначительным количеством меди и цинка. Около 90% всего количества меди находится в связанном состоянии, образуя с белком церуло­плазмином комплекс ярко-синего цвета, причем связь эта на­столько прочна, что никакого обмена не наблюдается. Концент­рации обменивающихся ионов меди и цинка в плазме крови со­ставляют 1,1 мкМ и 15 мкМ соответственно [Agarwal, Perrin, 1976]. Почти все обменивающиеся ионы меди связаны с кон­цевыми остатками альбумина NH₂-Asp-Thr-His (в плазме быка) и NH₂-Asp-Ala-His (в плазме человека). В связывании участву­ют ЫН₂-группы, два пептидных атома азота и имидазольный атом азота гистидинового остатка. Условная константа свя­зывания (выражаемая как log К¹) составляет 12,1 при pH 7,4 для комплекса медь — альбумин (1:1) и 7,6 для комплекса цинк — альбумин (1 : 1), хотя характер связывания цинка и ме­ди различается. Цинк в отличие от меди легко удаляется из; плазмы крови при инъекции комплекса кальций—ЭДТА. (11.27).

Металл в качестве кофактора необходим примерно 12% всех известных ферментов. Какую же роль он играет в этих, случаях? По-видимому, металл часто служит мостиком между субстратом и белком, причем последний способен активировать металл, акцептируя его свободные электроны. Образование из­быточного положительного заряда на атоме металла приводит к тому, что электронная плотность смещается от субстрата к металлу.

Подобная картина наблюдалась и при исследовании двух содержащих марганец ферментов — креатинкиназы и мышечной енолазы методом ЭПР. Было показано, что у первого из них марганец образует связь с коферментом (АДФ) и с субстра­том, но не с белком, а у второго — атом марганца, по-видимо­му, служит мостиком между субстратом и белком [Cohn, Leigh, 1962]. В других случаях роль металла, по-видимому, сводится исключительно к обеспечению необходимой третичной структуры белка (по аналогии с дисульфидным мостиком S—S). При образовании требуемой третичной структуры часто происходит сближение двух или трех остатков аминокислот, образующих активный центр, тогда как в вытянутой полипептидной цепи эти остатки располагаются далеко друг от друга. Примером •может служить атом цинка в молекуле щелочной фосфатазы •бактерий Е. coli: при удалении атома цинка спектр кругового дихроизма этого фермента резко изменяется под действием 6М мочевины, так как природная конформация превращается в беспорядочную спираль [Trotman, Greenwood, 1971]. Подроб­нее об этом ферменте см. разд. 11.0.

Многие ферменты, например трипсин, функционируют без участия металла. Однако те ферменты, которым необходимы тяжелые металлы, обычно удерживают их очень прочно. Поэто­му во многих случаях металл не удается удалить диализом и даже сильные хелатирующие агенты проникают в клетки мик­роорганизмов, не причиняя им вреда (разд. 11.7.1). Вероятнее всего, это обусловлено спецификой третичной структуры, а не высокими значениями констант устойчивости (см. выше).

Кроме аминокислот, белков и пептидов существует много других металлосвязывающих соединений, играющих важную роль во всех живых клетках. К ним прежде всего относятся птеридины (в том числе фолиевая кислота) и пурины, для комплексов которых с металлами были определены константы устойчивости [Albert, 1953; Albert, Serjeant, I960]; рибофлавин, ■обладающий наибольшим сродством к металлу в частично вос­становленном состоянии [Hemmerich, Veeger, Wood, 1965], спермин (11.4) и диамины спермидин (11.5) и путресцин (11.6).

Все виды фосфатов способны связывать металлы в живых клетках. Говоря о неорганических фосфатах, следует отметить, что для орто-фосфатов (Са²⁺, Mg²+, Zn²+, Cu²⁺) значения кон­стант устойчивости были заново определены и выяснилось, что комплексы, образованные в соотношении 1 : 1, например СаНРО₄, имеют тенденцию к образованию димеров типа Са₂Н2(РО₄)2 [Childs, 1970]. Данные для аналогичных пиро­фосфатов можно найти в работе Wolhoff, Overbeck (1959). Оп­ределены также константы устойчивости комплексов АТФ с Mg²+, Са²+, Мп²⁺, Со²+, Ni²+, Zn²+ и Cu²+ [Perrin, Sharma,

1966] и аналогичные величины для АМФ, АДФ, УТФ, ГТФ, ЦТФ, ИТФ [Phillips, 1966]. Как показывают потенциометриче­ское титрование и метод ЯМР ³¹Р, ионы магния прочно связа­ны с фосфатными группами АТФ [Tuck, Baker, 1973]. Констан­ты устойчивости комплексов Си²+, Са²+ и Fe³+ с ДНК имеют тот же порядок, что и комплексы этих металлов с АМФ, имею- 146

щим 'значительно меньшее сродство к катионам металлов, чем;- АТФ pBryan, Frieden, 1967]. Некоторые катионы более тяже­лых металлов в природе связаны с молекулами нуклеиновых кислот. Предполагают, что ионы цинка образуют координацион­ную связь с пуриновыми основаниями при обратимом скручи­вании и раскручивании спирали ДНК [Shin, Eichhorn, 1968]. Жирные кислоты цикла лимонной кислоты также связывают катионы металлов.

Насколько известно, константы устойчивости большинства перечисленных веществ близки по величине к константам устой­чивости комплексов аминокислот (табл. 11.1). Только у порфи- ринов константы имеют более высокие значения; порфирины настолько прочно удерживают железо, что не удалось обнару­жить никаких признаков обмена с его радиоактивным изото­пом [Hahn et al., 1940].

Из вышесказанного ясно, что опыты с микроэлементами нельзя проводить в присутствии фосфатного или цитратного буфера. Для pH в пределах 7,0—8,2 удобным буфером, не об­разующим хелатных связей, служит N-этилморфин (темпера­тура кипения 138—139 °С). Подробнее о других буферах см. Perrin, Dempsey (1974).

Хелатообразующие соединения, избирательно действующие на организмы разных классов. Исследования в области срав­нительной биохимии постоянно выявляют новые видовые раз­личия в связывании и использовании металлов (разд. 4.2 и 11.0).

Аэробным бактериальным клеткам необходимо пополнять за­пас железа из окружающей их среды, где оно содержится, в ос­новном в виде почти нерастворимого оксида железа (III) (ко­личество растворяющегося вещества составляет 10~³⁹ М). Од­нако существуют соединения, способные растворять и перено­сить железо, а также превращать его в биологически доступную форму. Эти так называемые сидерохромы содержатся в бакте­риях, дрожжах и грибах. Из них наиболее распространены фе­ноляты, например энтерохелин (энтеробактин) (11.7) и гидрок- саматы, например дефероксамин В (11.9). Сидерохромы обоих типов представляют собой слабые кислоты (рКа около 9) и спо­собны очень прочно связывать железо (III) (log К 45).

Наиболее важный сидерохром типа енолятов — энтерохелин, циклический триэфир N-(2,3-дигидроксибензоил)-L-серина. Это- соединение выделено из бактерий Е. coli [O’Brien, Gibson, 1970]. Gibson и Nielands (1974) установили механизм действия энтерохелина, использовав серию мутантов, каждый из которых был лишен способности осуществлять одну из биохимических стадий. Рентгеноструктурный анализ показал, что в молекуле энтерохелина каждый катион железа (III) связан с шестью ато­мами кислорода, предоставляемыми тремя фрагментами кате- холдианионов (11.8), что и придает комплексу пурпурную окраску [Anderson et al., 1976]. Бактерии выделяют энтерохе- 10*

лин, который образует комплекс с железом из окружакэщей среды; затем этот комплекс поглощается бактериями И/Гидро- лизуется специальными ферментами с образованием железа {O’Brien, Сох, Gibson, 1971J.

Микобактин Т (11.10)

Дефероксамины, подобные соединению (11.9), представляют собой гексапептиды, выделяемые из Streptomyces. Рентгено­структурный анализ показал, что шесть атомов кислорода, при­надлежащие трем группам гидроксамовой кислоты, образуют тетраэдрическую структуру, связывающую ион железа (III). Для этого соединения log К, равный 31, значительно выше, чем для ЭДТА (11.27) (log К 24), но ниже, чем log К энтерохелина [Schwarzenbach, Schwarzenbach, 1963].

Сидерохром микобактин Т (11.10) встречается у возбудите­лей туберкулеза человека. Восемь других микобактинов были получены из других разновидностей рода Mycobacteria. Эти со­единения имеют только две гидроксаматных группы, однако наличие фенольной группы, участвующей в трехцентровом свя­зывании иона железа, делает комплекс микобактинов с желе­зом таким же прочным, как и комплексы с другими сидерохро- мами [Snow, 1970]. Это единственные природные соединения железа, имеющие хорошую липофильность.

Значительные различия в использовании железа бактериями и млекопитающими открывают большие возможности для хи­миотерапии. О применении сидерохромов в качестве антидотов при отравлениях железом см. разд. 11.6.

Многие грибы, например Aspergillus aerogenes, выделяют энтерохелин, тогда как другие (в том числе Aspergillus niger и Penicillium reticulosum) удерживают железо с помощью ферри- хрома, циклического гексапептида, в молекуле которого ион железа прочно связан тремя гидроксаматными группами. Гри­бы содержат множество хелатирующих пиронов, таких, как койевая кислота (З-окси-ч-пирон) (11.11), суммарное значение логарифма константы устойчивости (^₃) которой для желе­за (III) равно 25. Биологическая роль этих соединений неизвест­на, так же как и роль полигидроксиантрахинонов, содержащих­ся в грибах. Все дрожжи выделяют производное гидроксамовой кислоты — родоторуловую кислоту (11.12) для доставки железа в клетки.

Микробный метаболизм железа см. обзор Nielands (1974). О

Койевая кислота

(11.11)

Мугинеивая кислота (11.13)

Тироксин

(П.14)

Таблица 11.1. Логарифмы констант устойчивости некоторых обозначены

¹ Цнстеин окисляется этим катионом.

² Ср. Ч1 для Си+.

⁴ Для Са²+ также ~3.

Комплекс марганца с бнпиридилом 2 : 1 (log р 6) обозначен как ²б, а ЭДТА 1 : 1

Данные для тетрациклина см. [Albert, Rees, 1956], изоииазида [Albert, 1956], сали днметнлдитнокарбаминовой кислоты [Janssen, 1958], аминокислот [Albert, 1950, 1952],

Растения также содержат специальные химические соедине­ния, способные связывать железо. Многие злаковые культуры выделяют в почву мугинеивую кислоту (11.13), способную об­разовывать с ионом железа (Fe³⁺) комплекс, который затем поглощается и используется растениями. Мугинеивая кислота представляет собой производное азотсодержащего циклического соединения азетидина. В отсутствие необходимого количества железа у растений наступает хлоротическое состояние и они увядают [Mino et al., 1981].

Некоторые природные агонисты млекопитающих, а именно тироксин (11.14), норадреналин (7.5) и гистамин (7.6) способ­ны связывать металлы. Только у млекопитающих в митохонд­риях накапливается кальций.

комплексообразующих агентов (в воде при 20 °С; насыщенные константы как Jog р)

(log р 13) — как 13.

цнловон кислоты [Perrin, 1958], бнпириднла и орто-фенантролнна [Irving, Mellor, 1962], остальные значения [Sillen, Martell, 1964, и дополнения].

11.2.