Осаждение путем избирательной денатурации

Этот способ выделения приемлем только для стабильных белков, сохраняющих устойчивость в экстремальных условиях внешней среды. Помещая такие БАВ в смеси с сопутствующими белка­ми в экстремальные условия, можно вызвать денатурацию ненужных белков.

Избирательная денатурация под воздействием pH — это более распространенный прием, чем термическая денатурация. Суть метода заключается в том, что при экстремальных значениях pH происходит денатурация нецелевых белков. Денатурация происходит потому, что отдельные участки белковой молекулы приобретают большое количество зарядов одного знака или теряют их, что приводит к отталкиванию этих участков друг от друга или их притяжению. Все это при­водит к денатурации белковой молекулы. pH-денатурация — сложный процесс, который может протекать как при значениях pH, близких к изоэлектрической точке белка, так и далеких от нее. Скорость денатурации в кислых и щелочных условиях значительно превышает скорость прото­нирования (она мгновенна). Скорость разворачивания глобулы лимитирует скорость всего процесса. Для каждой смеси белков должны экспериментально устанавливаться режимы изме­нения pH, температуры и длительности экспозиций для проведения pH-денатурации. Важно также и то, какими кислотами или щелочами устанавливается нужное значение pH. Надо стре­миться избегать использования сильных кислот и щелочей, так как они могут вызвать инакти­вацию не только балластных белков, но и целевого белка. Для установления pH в диапазоне от 5 до 8,5 используют трис-буфер и уксусную кислоту, в интервале pH до 4 — молочную кислоту, pH до 9 доводят диэтаноламином, а до pH 10,5 — карбонатом натрия и, только если необходимо установить pH ниже 4 или выше 10,5, применяют сильные кислоты и щелочи. После pH-денату­рации значение pH доводят до нейтрального, и денатурированные белки осаждаются, перед этим их некоторое время выдерживают при 25-30 °С. Отделение белка проводят центрифугированием.

3.7.