Цитогенетическое исследование

В работе для выявления цитогенетических аномалий в клетках КМ использовался метод дифференциальной окраски хромосом по Гимзе (G - band).

Путем стернальной пункции или трепанбиопсии брали 1 - 2 мл костного мозга в стерильную пробирку с гепарином.

концентрированной серной кислоте) предметные стекла в спирте. Клеточную взвесь желаемой плотности из последней порции фиксатора тщательно разбивали, пользуясь пастеркой с резиновой присоской на конце. Затем на охлажденное, влажное стекло наносили пипеткой 4-5 капель клеточной взвеси, одну возле другой. После удаления избытка жидкости со стекла (прикосновением к его краю фильтровальной бумаги) производили высушивание препарата быстрыми движениями возле источника тепла. Стекла маркировали и до окраски сохраняли при комнатной температуре.

Метод окраски хромосомных препаратов

Для процедуры окраски были необходимы следующие реактивы:

1. Раствор трипсина 0,25%.

2. Фосфатный буфер, pH 6,8 (NaCl -16г., КС1 -0,4 г., Na₂HPO₄ -2,3 г., КН₂РО₄-0,4 г., Н₂О - до 2000 мл).

3. Рабочий раствор красителя Гимзы (1 мл краски Гимзы + 49 мл фосфатного буфера).

4. Раствор Хенкса.

5. Спирты 70°, 96°, 100°.

Предметные стекла помещали в раствор трипсина на 15 - 30 сек при комнатной температуре, после чего ополаскивали последовательно в спиртах с разным разведением (70° - 96° - 100°), в каждом не менее 30 сек.

По окончании времени окрашивания предметные стекла ополаскивали дистиллированной водой для удаления излишков краски, высушивали и приступали к микроскопии.

культуральную смесь добавляли колцемид (или колхицин) в концентрации 0,05 - 0,1 мкг/мл сроком на 30 мин. После 30-минутной обработки клеток колцемидом (колхицином) содержимое пробирки центрифугировали в течение 8 мин при 800 оборотах в мин. (перед центрифугированием не диссоциированные клеточные агрегаты осторожно удаляли пипеткой). По окончании центрифугирования, супернатант удаляли пипеткой, оставляя небольшое количество культуральной смеси над осадком клеток. К клеточному осадку добавляли 3 - 5 мл теплого гипотонического раствора хлористого калия, клетки в нем ресуспендировали, после чего доливали гипотонический раствор до конечного объема 7-9 мл. Клетки в гипотоническом растворе выдерживали в термостате при +37° 10-15 мин. После гипотонизации клетки переводили в осадок путем центрифугирования, после чего недосадочную жидкость удаляли, а осадок клеток подвергали фиксации. В качестве фиксирующей смеси использовали метанол и ледяную уксусную кислоту в соотношении 3:1. Смесь приготавливали заранее перед фиксацией и охлаждали в камере морозильника. К осадку' клеток после гиногонизации фиксатор наливали по стенке пробирки, при этом осадок клеток предварительно тщательно встряхивался. Клетки ресуспендировались пипеткой в фиксирующей смеси, объем которой в пробирке составлял 5-7 мл. Клетки проходили обычно 3-4 смены фиксатора, каждый раз сменяя его центрифугированием. Общая продолжительность фиксации - от 40 мин до 1,5 часа. Показателем завершенности фиксации клеток являлась бесцветность и прозрачность последней смены фиксатора, после того как в нем была ресуспендирована клеточная взвесь.

Следующим этапом было приготовление хромосомных препаратов. Задачей процедур этого этапа являлось получение хорошо «распластанных» метафазных пластинок с сохранением целостности и полноты хромосомного набора в каждой из них. Достигалось это следующим образом. В холодильник заблаговременно помещали хорошо вымытые (в стиральном порошке) и обезжиренные (в растворе хромовокислого калия, приготовленного на

2.2.3.