Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли.
Возможные проблемы при проведении реакции
При использовании различных методов визуализации антигенов должно получиться интенсивное четко выявляемое окрашивание тканевых антигенов в исследуемом образце и позитивном контроле.
Окрашивание негативного контроля также необходимо принимать во внимание при оценке специфичного расположения исследуемых антигенов. Интерпретация полученных результатов ИГХ реакции включает такие термины, как «выраженная позитивная реакция», «ложно-позитивная реакция», «негативная реакция», «ложно-негативное окрашивание».Негативную реакцию сложно интерпретировать, в отличие от позитивной, для этого необходимо провести контрольные исследования с различными дополнительными антителами. Так, при выявлении гистогенеза недифференцированной злокачественной опухоли на предмет рак это или лимфома, отрицательной реакции с антителами на кератин (промежуточный филамент, выявляемый в большинстве раков) недостаточно для постановки диагноза лимфомы. Необходимо провести дополнительное исследование и получить положительное окрашивание опухолевых клеток на общий лимфоцитарный антиген (белок, характерный для большинства лимфом).
Контроль иммуногистохимической реакции
При любом иммуногистохимическом исследовании необходимо использовать различные контрольные тесты для оценки адекватности методической процедуры. Для подобных процедур исследуют стекла с тканью положительного и негативного контроля для того, чтобы убедиться в том, что 1) система визуализации работает адекватно, 2) положительное или негативное окрашивание является специфичным, 3) полностью соблюдена методическая последовательность.
Контроль ИГХ реакции означает оценку специфичности взаимодействия антител с тканевыми антигенами. С этой целью используют отрицательный и положительный контроль.
Отрицательный контроль.
• Для отрицательного контроля берут срезы тканей, в которых заведомо нет искомого антигена.
Результаты реакции должны быть отрицательными.• При проведении ИГХ реакции исключают инкубацию с первичными антителами, заменяя их неиммунной сывороткой. Результаты реакции должны быть отрицательными.
• Антитела (в максимальном разведении) предварительно адсорбируют специфическим антигеном (0,1-10 нмоль/ мл), затем их наносят на срезы в качестве контроля. Результаты реакции должны быть отрицательными. После адсорбции специфическим антигеном антитела должны терять способность окрашивать ткань. Подобный контроль необходимо ставить с каждой новой антисывороткой и при обнаружении новых участков взаимодействия антител с тканью.
Положительный контроль.
В любом опыте важно иметь положительный контроль - окрашивать ткань, заведомо содержащую исследуемые антигены, для того чтобы убедиться, что все антитела работают нормально. В качестве положительного контроля
служат срезы тканей, в которых исследуемый антиген заведомо присутствует. Результаты реакции должны быть положительными.
Возможные проблемы, возникающие при проведении ИГХ реакции
Если наблюдается сильное фоновое окрашивание, то необходимо:
• до нанесения первичных антител провести блокирование нормальной сывороткой животного, донора вторичных антител, либо использовать готовые антитела для блокирования мест неспецифического связывания антител, значительно снижающие фоновую неспецифическую окраску срезов;
• использовать более высокие разведения первичных и/или вторичных антител. В результате разведения абсолютное количество загрязненных антител падает, в то время как количество специфических антител остается достаточным для визуализации антигенов;
• возможно, во время инкубации с сыворотками срезы подсохли;
• уменьшить время инкубирования первичных антител;
• снизить температуру при инкубации первичных антител;
• уменьшить время инкубации субстрата;
• более тщательно промывать срезы после инкубации с антителами;
• провести адсорбцию первичных и вторичных антител альбумином.
Неспецифическое связывание иммуноглобулинов с компонентами ткани за счет гидрофобных или электростатических взаимодействий можно предотвратить путем адсорбции антисыворотки альбуминами животного, ткань которого предстоит окрашивать. При этом блокируются большинство участков неспецифического связывания, но образующиеся связи слабее, чем связь антигенантитело и не мешают взаимодействовать специфическим антителам с антигеном. К рабочему раствору антител можно также добавить нормальную сыворотку до концентрации 1%;• внести в буфер, используемый для промывки, детергент (0,2% тритон Х-100) для снижения неспецифического связывания белка;
• попытаться дополнительно заблокировать эндогенную пероксидазу например 3% или 6% раствором перекиси водорода, нитроферрицианидом натрия или смесью периодат-борогидрид;
• ткани обладают эндогенной биотиновой активностью. Необходимо провести блокирование эндогенной биотиновой активности, используя авидин- биотин блокирующие реагенты до нанесения первичных антител;
• антитела и исследуемая ткань принадлежат к одному виду животных. Мышиные антитела используются для выявления антигенов в тканях мыши;
• удалить комплемент из препарата первичных антител, прогревая антисыворотку 30 мин при 56°С.
Возможные причины слабого окрашивания всех срезов:
• неадекватная фиксация ткани. Необходимо сделать криостатные срезы замороженной нефиксированной ткани, фиксировать их в различных фиксаторах, затем проводить ИГХ реакцию;
• ошибки при осуществлении демаскирования антигенов;
• антиген был разрушен до инкубации с первичной сывороткой. Следует провести блокирование эндогенной пероксидазной активности после проведения реакции с первичными антителами;
• низкая концентрация первичных или вторичных антител. Для подбора оптимальной концентрации антител необходимо провести пробную ИГХ реакцию с их различными разведениями;
• ошибки или пропуск одной из процедур иммунохимического окрашивания. Возможно использование вторичных антител, которые специфически не взаимодействуют с первичными.
Если используются первичные мышиные антитела, необходимо применить вторичные антимышиные антитела;• слишком короткое время инкубации с первичными антителами;
• слишком низкая температура при инкубации с первичными антителами;
• старый субстрат. Свежий субстрат как правило представляет светло розовый раствор, появление коричневой окраски свидетельствует о том, что субстрат - старый;
• слишком интенсивное смывание реагентов буфером привело к разведению реагентов;
• несовместимость реагентов докрашивания или заключения срезов с продуктами реакции;
• неполная депарафинизация срезов. Необходимо продлить время депарафинизации срезов, либо заменить ксилол;
• антитела не работают из-за неправильного их хранения. Хранить антитела желательно в замороженном состоянии в небольших объемах при температуре -20°С - -70°С, избегая повторного замораживания и оттаивания антител.
Причины окрашивания только срезов с положительным контролем, в то
время как исследуемая ткань не окрасилась, могут быть следующие:
• в исследуемой ткани нет искомого антигена или его концентрация незначительна. Необходимо увеличить время инкубации первичных антител;
• неадекватная обработка исследуемой ткани, вызвавшая денатурацию исследуемых антигенов;
• образцы слишком долго фиксировались в формалине. В результате произошло маскирование антигена за счет кросс-связывания альдегидов и увеличения гидрофобности ткани. Возможно, для демаскирования антигена необходимо провести дополнительное нагревание срезов в микроволновой печи или обработку ферментом;
• иммунореактивность уменьшилась или повредилась во время обработки тканей при высокой температуре. Не следует нагревать образцы выше 60°С.
Срезы слетают с предметных стекол:
• исключить детергенты из буфера для промывания срезов;
• прогреть парафиновые срезы в термостате в течение 2 суток при температуре 37°С;
• нарушена морфология исследуемой ткани;
• плохая фиксация ткани;
• ткань повреждена из-за высокой концентрации или длительной обработкой детергентами (Triton X-100).