Тема № 6. Белки - маркеры клеточного цикла

В основе развития раковых опухолей лежит пролиферация клеток, кото­рая приводит к увеличению числа анапластических элементов.

Цикл деления или пролиферации клеток можно разделить на две основ­ные «сверочные точки» (checkpoints) S и M и две подготовительные точки - G₁ и G2.

Универсальным маркером для оценки клеточного цикла является белок Ki-67, по экспрессии которого можно исследовать пролиферативную актив­ность клеток. Антитела к Ki-67 выявляют пролиферирующие клетки, находя­щиеся в разных фазах цикла. Это наиболее надежный и четкий маркер проли­ферации. Антиген Ki-67, выявляемый соответствующими моноклональными антителами, представляет собой короткоживущий протеин, он разрушается в течение 1,5-2 часов. Поэтому, антитела к Ki-67 выявляют только делящиеся клетки, так как Ki-67 не успевает накапливаться и не остается в покоящихся клетках (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2000).

Ki-67 представлен двумя различными формами с молекулярной массой 320 kD и 359 kD. Кодирующий их ген локализуется в 10 хромосоме и состоит из 15 экзонов. Белок Ki-67 в основном связан с хромосомами, выявляется в об­ласти теломер, центромер, в ядрышках. Он очень лабилен в присутствии проте­аз, это затрудняет его изучение и поэтому связь с белками, регулирующими клеточный цикл, мало изучена и четко не определена. Однако показано, что микроинъекции антител к Ki-67 приводят к снижению пролиферативной актив­ности клеток.

Прохождение основных точек клеточного цикла требует активирования внутриклеточных ферментов, известных как циклин-зависимые киназы (Cdk), для активности которых требуется присутствие активаторной субъединицы - циклина. Таким образом, каждая из Cdk не может активироваться пока для неё не будет синтезирован специфический циклин. Экспрессия каждого из цикли­нов и Cdk изменяется в определенные фазы клеточного цикла. Переход клетки из точки G0 в G1 характеризуется образованием комплексов циклинов D (D1- D3) в зависимости от типа клеток с Cdk4 или Cdk6. Переход из G1 в S связан с образованием комплексов циклина E c Cdk2. Вход в митоз обусловлен образо­ванием комплексов циклина B с Cdc2 и т.д. Другими участниками регуляции клеточного цикла является наличие белков, известных как ингибиторы циклин- зависимых киназ - CKI, которые могут блокировать процессы активирования различных киназ. Имеются два класса ингибиторов Cdk. Один класс тормозит несколько Cdk и включает p21CIP4, p27KIP1 и p57KIP2. Другие ингибиторы Cdk являются специфичными и тормозят эффект отдельных комплексов цикли­нов с соответствующими Cdk-комплеком циклин D/Cdk4 (или Cdk6) и включа­ют p16INK4, p15INK4B, p18INK4C и p19INK4D.

Выход покоящейся клетки из точки G0 и вступление её в митотический цикл инициируется различными внешними стимулами - цитокинами, принад­лежащими к группе факторов роста. Связывание рецепторов со своими лиган­дами - ростовыми факторами и белками внеклеточного матрикса (фибронекти- ном, коллагеном) индуцирует аутофосфорелирование ферментных систем ре­цепторов и последующее их взаимодействие с сигнальными белками. В резуль­тате этого происходит активация киназных каскадов - MAP (Mitogen Activated Proteins).

Торможение клеточного цикла основано на активации CKI семейств Ink4 и Cip/Kip, что приводит к остановке клеточного цикла в определенных его точ­ках G1, S, G2 и M. Синтез, активирование и разрушение подобных CKI регули­

руется в ответ на митогенные и амитогенные сигналы. Так, регуляция клеточ­ного цикла под действием трансформирующего фактора роста (TGF-B) осуще­ствляется ингибитором Cdk - p27KIP1.

Патологические изменения в механизмах регулирования клеточного цикла достаточно подробно описаны при развитии цервикальной интраэпите­лиальной неоплазии. Вирус папилломы человека высокого риска вызывает экс­прессию вирусного онкогена в реплицирующихся стволовых клетках. На этом этапе продукты генов Е6-Е7 перехватывают контроль клеточного цикла и ми­тотической активности и в дальнейшем индуцируют многоступенчатый мута­генез с тяжелой геномной нестабильностью. Детальный молекулярный анализ этой активности позволил выделить биомаркеры неопластических клеток шей­ки матки. Выраженная гиперэкспрессия ингибитора циклинзависимой киназы p16INK4a регулярно наблюдается в злокачественных поражениях, вызванных вирусом человеческой папиломы высокого риска и свидетельствует об актив­ной экспрессии вирусного онкогена Е7 в пораженных клетках. Морфологиче­ски эти молекулярные расстройства отражаются, в основном, в изменении ядерно-цитоплазматического соотношения, анизонуклеозе, гиперхромазии. При иммуногистохимической реакции на p16INK4a окрашиваются атипические клетки, которые легко могут быть обнаружены даже при малых увеличениях, а при больших увеличениях могут быть отдифференцированы от атрофических или метапластических клеток. В сомнительных случаях помогает дополнитель­ное использование маркеров пролиферации, таких как Ki-67, PCNA и др. Ис­пользование новых иммуногистохимических маркеров значительно снижает частоту ложноотрицательных и ложноположительных результатов при тради­ционных методах диагностики рака и предрака шейки матки.

В отличие от контролируемого различными ферментными системами де­ления нормальных клеток, быстрая пролиферация опухолевых клеток происхо­дит из-за нарушения регулирующих механизмов работы Cdk в клеточном цик­ле, в основе которых чаще всего лежит гиперэкспрессия циклина D1 за счет ам­плификации соответствующего гена, расположенного в хромосоме 11q13. По­

добные процессы выявлены при меланоме, раке легких, молочной железы, мо­чевого пузыря, пищевода и плоскоклеточном раке в области головы и шеи. Ги­перэкспрессию циклина D1 в этих опухолях можно выявить иммуногистохими­ческим методом в большинстве ядер опухолевых клеток. Гиперэкспрессию циклина D1 за счет его транслокации в хромосомах можно также выявить в саркомах, раке толстого кишечника, В-клеточной лимфоме мантийной зоны. Циклин D1 активирует клеточный цикл от G0 до S фазы под влиянием факторов роста, в свою очередь, независимая экспрессия циклина D1 может вызвать ав­тономную активацию циклин D1/Cdk4 и привести к продолжительному деле­нию клеток даже без наличия соответствующих факторов роста. Гиперэкспрес­сия циклинов D2 и D3 отмечается при раке толстой кишки. Мутации или деле- ции INK4 - ингибитора Cdk4 и Cdk6 выявлены при наследственных формах меланомы, раках пищевода, поджелудочной железы, легких, яичников, злока­чественных опухолях головы и шеи.

Ключевым регулятором G1/S фаз клеточного цикла является и ген rb (ре- тинобластомы). Белок pRb представляет собой фосфобелок c молекулярной массой 105кД, локализующийся в ядре и экспрессирующийся в большинстве типов клеток. Он дефосфорилирован в неделящихся клетках, а также в проли­ферирующих клетках, находящихся в начале точки G1 клеточного цикла. В таком состоянии pRb образует комплексы с рядом белков, в том числе с белка­ми, вызывающими ремоделирование хроматина (гистоновые деацетилазы HDAC, комплексы SWI-SNF) и транскрипционными факторами семейства E2F, регулирующими активность генов, продукты которых необходимы для начала и прохождения S-фазы.

Белок pRb играет ключевую роль в контроле последовательности собы­тий, обеспечивающих переход клетки из G0/G1 в S фазу и ее успешное завер­шение.

ток, в которых будут накапливаться и другие онкогенные мутации, ведущие к злокачественной трансформации. С патологией rb гена связывают возникнове­ние ретинобластомы, мутации этого гена наблюдаются при остеосаркоме и саркомах мягких тканей, раке молочной железы, предстательной железы, моче­вого пузыря, почек, печени, поджелудочной железы, шейки матки, легких и при лейкозах.

Другой важный ингибитор Cdk в фазах G1/S и G2/M клеточного цикла представлен геном p53, этот опухолевый супрессорный ген наиболее часто подвергается мутации при раках.

Основная транскрипционная мишень p53 в системе контроля клеточного цикла - белок p21^Waf1. Повышение экспрессии p21^Waf1/Cip1 в ответ на гиперэкс­прессию p53 и повреждение ДНК вызывает остановку клеточного цикла в поздней G1 фазе. P21^Waf1/Cip1 связывается с комплексами [циклин E/Cdc2], тем самым подавляя их способность фосфорилировать белки, активность которых необходима для входа клеток в S фазу. Идентифицирован также ряд генов- мишеней p53, продукты которых вызывают остановку в фазе G2. Задержка в ней наблюдается в случае, когда p53 активировался уже после того, как клетка прошла G1 фазу (Копнин Б.П., 2001). Активированный p53 подавляет функцию комплекса [циклин B/Cdc2]. Во-первых, он трансактивирует ген 14-3-3о, белко­вый продукт которого связывает и транспортирует комплексы циклин B/Cdc2 в цитоплазму. Во-вторых, p53 трансактивирует ген GADD45, белковый продукт которого обладает способностью связывать Cdc2, разрушая, таким образом, комплексы циклин B/Cdc2. В-третьих, p53 репрессирует транскрипцию генов циклина B и Cdc2, что уменьшает синтез их продуктов.

Одной из функций p53 является остановка клеточного цикла после по­вреждения генома в точке G1, это позволяет клетке восстановить целостность поврежденной ДНК до её репликации и деления клетки, если восстановить ДНК не удается, то p53 запускает в клетке механизм апоптоза. Потеря функции p53 снижает стабильность генов, что, в свою очередь, может привести к акти­

вированию дополнительных мутаций, приводящих к неопластической транс­формации клеток.

В последнее время для определения пролиферативной активности клеток используют молекулярный маркер MCM2 (Mini Chromosome Maintenance pro­tein 2), увеличение экспрессии которого обнаружено при цервикальной интра­эпителиальной неоплазии, плоскоклеточных раках шейки матки, кожи, легких, пищевода, переходноклеточном раке мочевого пузыря, аденокарциномах эндо­метрия и простаты, муцинозной аденокарциноме яичников, почечноклеточном раке, лимфомах, олигодендроглиоме. Величина экспрессии MCM2 коррелирует со степенью дифференцировки опухолей. Индекс метки MCM2 повышен в эпи­телии полости рта при его дисплазии и является надежным маркером пролифе­рации клеток. Многие авторы рекомендуют использовать MCM2 в качестве маркера пролиферативной активности клеток наряду с Ki-67 и циклином D1.

MCM2 - белок из семейства MCM (MCM2-7), был обнаружен в дрож­жах Saccharomyces cerevisiae как фактор, необходимый для поддержания цело­стности и стабильности минихромосом. В ранней Gl-фазе клеточного цикла на молекуле ДНК происходит сборка молекулы ORC (origin recognition complex - комплекс, распознающий точки начала репликации), Cdc6 (cell division cycle protein 6 - белок регулятор клеточного цикла 6) и MCM в предрепликационный комплекс, что делает ДНК готовой к репликации («лицензирование» реплика­ции). Сборка предрепликационного комплекса - необходимое условие началь­ной стадии репликации ДНК, без которого невозможно деление клетки.

Ген mdm2 кодирует белок, который связывает белок P53 и приводит к по­следующему его разрушению. Большое количество белка MDM2 в клетке при­водит к инактивации P53. Гиперэкспрессия этого белка, вызванная амплифика­цией соответствующего гена, выявляется при различных саркомах.

Пролиферация опухолевых клеток связана с вовлечением тех же меха­низмов, что и у нормальных клеток, основные изменения наблюдаются при прохождении ключевых точек клеточного цикла. Несмотря на выявление большого количества протоонкогенов и опухолевых супрессоров, вовлеченных

в трансдукцию сигналов и нарушения пролиферативных механизмов в ключе­вых точках клеточного цикла, развитие онкопатологии связано с нарушением системы pRb и p53. Именно мутации этих двух генов наблюдаются в боль­шинстве опухолевых клеток человека, и нарушения Rb и p53 сигнальных путей являются необходимыми для появления постоянно пролиферирующих неопла­стических клеток.

Таким образом, иммуногистохимические исследования клеточных марке­ров пролиферативных процессов при злокачественных опухолях помогают по­ставить диагноз неоплазии и определить прогноз онкологического заболевания.