Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации

Изменения в генетическом аппарате опухолей связаны с их генетически запрограммированной клеточной гибелью, обозначаемой термином «апоптоз» (Kerr J.F.R. et al., 1972). Программированная клеточная смерть может быть раз­делена на три фазы: активация сигнала - индукция апоптоза, регуляция и вы­полнение (эффекторная фаза), структурное клеточное повреждение.

Активация сигнала

Существует широкий диапазон внутренних и внешних стимулов, спо­собных запустить апоптоз: гормоны, цитокины, повреждение ДНК, недостаток ростовых факторов, повышенная экспрессия генов опухолевых супрессоров, факторы гибели, продуцируемые соседними клетками, фармакологические препараты и т. д.

Факторы, способные повреждать ДНК, такие как облучение, цитостати­ческие или генотоксические воздействия также могут запускать апоптоз. Изме­нения ДНК обнаруживает транскрипторный фактор p53, он блокирует клеточ­ный цикл в фазах G1 и G2 до репликации ДНК и митоза, соответственно, дела­ет возможной репарацию поврежденной ДНК и предотвращает появление му­таций в клетках. Если активность репарационных систем недостаточна и по­

вреждения ДНК сохраняются, то p53 запускает апоптоз, стимулируя транс­крипцию некоторых проапоптозных генов, включая bax и fas, что приводит к защите организма от клеток, способных к злокачественной трансформации.

Опухолевый супрессор p53 координирует все основные процессы под­держания стабильности генома, являясь центральным компонентом системы контроля повреждений в клетке. В этом качестве p53 регулирует экспрессию более десяти белков, ответственных за активацию различных супрессорных систем. Среди них - индукторы апоптоза, регуляторы клеточного цикла, секре­тируемые ингибиторы роста и ангиогенеза. Невыясненной остается функция еще множества генов, для которых p53 также является фактором транскрипции.

В обычных («нестрессовых») условиях практически весь p53 инактивиру­ется протоонкогеном Mdm2.

Число p53-регулируемых генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, невелико, в отличие от огромного и до сих пор растущего числа потен­циальных медиаторов р53-зависимого апоптоза. Такое многообразие объясня­ется тем, что в клетках разных тканей, а также в клетках, находящихся в раз­личных физиологических условиях, могут реализоваться альтернативные про­граммы р53-зависимого апоптоза. При этом p53 контролирует синтез двух ос­новных путей индукции апоптоза: митохондриального и стимулируемого «ре­цепторами смерти».

Регуляция и выполнение (эффекторная фаза)

Морфологические изменения, которые наблюдали J.F.R. Kerr с соавт. (1972) в апоптотических клетках, являются результатом расщепления белков цитоскелета и ядерной оболочки каспазами (цистеиновыми протеазами). В клетке каспазы синтезируются в форме латентных предшественников - про­

ферментов, называемых прокаспазами. По выполняемой каспазами функции их можно разделить на две основные группы: инициаторные каспазы (8, 9 и 10) и эффекторные каспазы (3, 6 и 7). На этапе активации инициирующих прокаспаз жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блоки­руют или, напротив, усиливают разрушительное действие инициирующих кас­паз. К ним относятся антиапоптозный белок BCL-2 и проапоптозный белок BAX. После того, как каспазы из первой группы активируют эффекторные кас­пазы, процесс, запущенный «программой смерти», оказывается необратимым. Активация инициирующих прокаспаз может происходить в ответ на действие лигандов через клеточные рецепторы (внешний апоптотический путь) или в ответ на сигналы из самой клетки (внутренний апоптотический путь).

Внешняя апоптотическая передача сигналов происходит путем активации так называемых «рецепторов смерти», которые представлены рецепторами на поверхности клеток и передают апоптотический сигнал после взаимодействия с определенными лигандами.

Внутренняя апоптотическая передача сигнала происходит путем образо­вания в митохондриальных мембранах мегаканалов, так называемых «гигант­ских пор». В результате открытия этих пор из митохондрии выходят апопто- генные факторы, которые и запускают механизмы, приводящие к апоптозу. Комплекс BCL-2 взаимодействует с гигантской порой и это взаимодействие яв­ляется важнейшим звеном регуляции проницаемости митохондрии.

Bcl-2 семейство

Bcl-2 (B cell lymphoma/leukemia-2) гены локализованы на 18 хромосоме и играют важную роль в определении, будет ли клетка необратимо подвержена апоптозу. Известно, что Bcl-2 — только один член этого семейства, состоящего из многочисленных белков, гомологов Bcl-2. Другие члены bcl-2 семейства ге­

нов, вероятно, играют важную роль в регулировании апоптоза при помощи ме­ханизмов, которые являются противоположными или комплиментарными дей­ствию Bcl-2. Члены данного семейства взаимодействуют через гомодимерные или гетеродимерные ассоциации так, что восприимчивость клеток к потенци­альному апоптотическому стимулу может быть определена степенью проапоп- тотических и антиапоптотических воздействий представителей этой группы белков, находящихся в клетке в данное время.

Проапоптозный белок Bax является членом Bcl-2 семейства. Он увеличи­вает восприимчивость клеток к клеточной смерти, возможно, противодействуя эффекту антиапоптозного белка Bcl-2 на клеточное выживание путем гетеро­димерного взаимодействия. Белки Bcl-2 и Bax формируют гомодимеры либо гетородимеры. Bax-Bax гомодимеры индуцируют апоптоз, гетеродимеры Bcl-2- Bax препятствуют процессам апоптоза как в нормальных, так и в патологиче­ских тканях.

Другой член этого семейства генов, bcl-x, представляет интересный при­мер одиночного гена, который через альтернативные связанные механизмы ко­дирует положительную и отрицательную регуляцию апоптоза.

В норме ген р53 функционирует как «молекулярный полицейский», осу­ществляющий защиту генома. Нарушения процессов апоптоза наступают в том случае, если ген р53 теряет свои функции. Это может произойти в условиях па­тологии, когда в результате мутации гена p53 образуется его мутантный аналог - mt p53. Мутация p53 приводит к нарушению внутриклеточных механизмов регуляции клеточного цикла и не дает реализоваться апоптозу, чем способству­ет опухолевому росту.

Белок P53 постоянно синтезируется в клетках, но является короткоживу­щим белком. Мутации гена p53 ведут к «сверхэкспрессии» этого белка, которые иммуногистохимическим путем выявляются с помощью анти-Р53 антител. Му­тированный ген р53 является ранним маркером процессов малигнизации и опу­холевой прогрессии. Во многих типах опухолей человека обнаружена корреля­ция между увеличением экспрессии mt p53 и нарастанием морфологической атипии и степени злокачественности. Для иммуногистохимического выявления Р53 широко используются моноклональные антитела. В методическом плане следует подчеркнуть, что дикий тип Р53 - короткоживущий протеин, его пери­од полураспада не превышает 20 минут, поэтому в клетке его очень мало (не больше нескольких тысяч молекул в одной клетке) и его содержание практиче­ски может быть ниже чувствительности иммуногистохимических методов. Му­тантный тип Р53, напротив, долгоживущий протеин, его период полураспада длится до 24 часов, и он успевает накапливаться в количествах, вполне доста­точных для иммуногистохимической идентификации.

Несмотря на обилие методов выявления апоптоза, данные относительно его развития в клетках неоднозначны, основные противоречия связаны с осо­бенностями методических приемов при изучении программированной клеточ­ной гибели. Для разрешения описанных выше недостатков методов И.И. Баби- ченко с соавт. (2002) предложили новый подход к изучению апоптоза, позво­ляющий оценивать его с принципиально новых позиций, т.е. оценивать его признаки до развития фрагментации ядер.

Для оценки апоптоза был использован новый фактор дифференцировки клеток HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), который первоначально был выделен из среды культивирования промиелоцитарного лейкоза человека HL-60, обработанных полностью-транс-ретиноевой кислотой. Данный фактор представляет собой небольшой гликозилированный белок с молекулярной мас­

сой 8.2 кДа, индуцирующий дифференцировку исходных активно пролифери­рующих клеток HL-60 по гранулоцитарному пути (Костанян И.А. и др., 1994).

HLDF играет важную роль в процессе апоптоза, поскольку как сам фак­тор HLDF, так и его ДНК-гидролизующий фрагмент, принимают участие в процессах запрограммированной гибели клеток. Скорее всего, зрелый фактор дифференцировки (и его предшественник) непосредственно участвуют во фрагментации ДНК в клетках миелоидного ряда с запущенным процессом про­граммированной гибели. Направления развития метаболизма - апоптоз, или дифференцировка - зависят от физиологического состояния клетки. Были по­лучены поликлональные антитела против фактора дифференцировки HLDF. Специфичность связывания антител подтверждалась иммуноблоттингом с син­тезированным пептидом HLDF. Иммуногистохимическое окрашивание клеток HL-60 с помощью поликлональных антител против HLDF показало, что только в дифференцированных под воздействием ретиноевой кислоты или введенных в апоптоз обработкой церамидом C2-Cer (N-ацетил сфингозин) в течение суток клетках, наблюдается специфическое точечное окрашивание ядер и цитоплаз­матической мембраны.

Результаты иммуногистохимических исследований позволяют сделать заключение, что фактор HLDF может быть использован в качестве маркера апоптоза. Гиперэкспрессия этого фактора в цитоплазме клеток, содержащих ядра, позволяет оценивать ранние фазы развития программированной клеточ­ной смерти, еще до формирования апоптозных телец.

Патология процесса апоптоза в клетках играет важную роль в накоплении генетических клеточных повреждений, ответственных за развитии опухолевой прогрессии. При этом опухолевые клетки получают возможность выживать без наличия экзогенных факторов роста, становятся устойчивыми к гипоксии, ак­тивизируют пролиферативные процессы, в них нарушается дифференцировка, клетки стимулируют ангиогенез, приобретают клеточную подвижность и инва­зивный рост. Нарушения апоптоза активируют метастазирование, позволяя

отдельным эпителиальным клеткам выживать вне связи с внеклеточным мат­риксом. Таким образом, патология апоптоза является фундаментальной причи­ной возникновения злокачественных опухолей.

Существуют некоторые взаимосвязи между регуляцией пролиферации клеток и апоптозом. Так, известно, что в большинстве медленно пролифери­рующих опухолей, таких как хронический лимфоцитарный лейкоз, индолент- ные Неходжкинские лимфомы, миелома, а также раки толстого кишечника и молочной железы, наблюдается гиперэкспрессия антиапоптотических белков Bci-2 и Bci-XL. Имеются данные, что Bci-2 и родственные ему белки обладают двумя различными функциями: они не только тормозят апоптоз, но и вхожде­ние клетки в клеточный цикл. Замедление вхождения клетки в клеточный цикл можно связать с лучшим прогнозом у пациентов с раком молочной железы и высоким уровнем экспрессии Bci-2. Неактивные лейкозные клетки также ги- перэкспрессируют Bci-2 и Bci-XL, по сравнению с активно пролиферирующи­ми аналогами.

Таким образом, апоптоз представляет собой универсальный механизм физиологической и патологической гибели клеток. Феномен апоптоза привлек к себе внимание исследователей тем, что он расширил представление о меха­низмах возникновения как опухолевых, так и неопухолевых заболеваний. Если раньше считалось, что опухоли возникают только за счет неконтролируемой пролиферации клеток, то сейчас установлено, что нарастание клеточной массы может происходить также и за счет нарушения процесса гибели клеток.