Методы исследования.

Анализ метилирования генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK. Выделение

геномной ДНК из опухолевого материала.

Для получения ДНК ткани опухоли использовали следующий метод выделения ДНК [116].

Ткань опухоли отмывали 1 ml PBS, измельчали и затем гомогенизировали. Гомогенат переносили в пробирку, затем добавляли экстракционный буфер (10 мМ Tris-НСІ, 2 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCl, рН=8,0) и протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0,5 %. Инкубировали 2 часа при 37⁰С до получения прозрачного раствора. Далее проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформом с последующим центрифугированием и отбором верхней фазы. Полученный в результате раствор ДНК перемешивали с 1/10 объема 5 М ацетата натрия, рН 5,3, и ДНК осаждали с помощью 2,5 объемов холодного 96% этанола, выдерживали образец 30 мин при температуре - 70⁰С.

Пробу центрифугировали при 0⁰С 15 мин с ускорением 12000 g. Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН 8,0.

Выход ДНК составлял 25-50 мкг на 1г ткани. После полного растворения ДНК, измеряли ее концентрацию на спектрофлюориметре фирмы «Hoefer» (Германия) и снимали спектр поглощения в диапазоне от 220 до 320 нм, с целью определения чистоты ДНК. При этом проверяли выполнение следующих условий: отношение поглощения на длинах волн 230нм/260нм < 0,5, 260нм/280нм >1,8. Максимум поглощения наблюдался в районе 260 нм.

Рестрикционный анализ.

Для определения аномального метилирования проводилась обработка опухолевой ДНК соответствующей метилчувствительной рестриктазой HpaII по следующей схеме: к 1000 нг геномной ДНК добавляли 10 е.а. фермента и 2 мкл соответствующего 10хбуфера, доводили до 20 мкл дистиллированной водой и оставляли на 10 часов в термостате при температуре оптимальной для используемой

рестриктазы.

Определение аномального метилирования промоторных областей генов- супрессоров опухолевого роста MLH1, N33, CDH1, RASSF1A и DAPK.

Метилирование CpG-островков промоторных областей генов определяли при помощи метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК гидролизованную метилчувствительными рестриктазами HpaII (CCGG). Геномую ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед активной рестриктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение ночи. Для амплификации использовали 150 нг гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтов узнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте, который содержал не менее трехчетырех HpaII сайтов. В случае модификации цитозинов в метилцитозин ДНК не расщепляется, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования ДНК полностью гидролизуется, и продукт ПЦР не образуется.

С целью исключения ложноотрицательных результатов проводили мультилокусные ПЦР с двумя парами праймеров: один фрагмент принадлежал изучаемому гену (MLH1, N33, CDHl, RASSF1 и DAPK), другой служил внутренним контролем (фрагмент гена MeCP2, не содержащий сайтов узнавания указанных рестриктаз). ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтри- фосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl₂, 10% диметилсульфоксида. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95⁰С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95⁰С - 30 с, отжиг и элонгация при 58-62⁰С - 2 мин 30 с.

Праймеры для исследуемых генов и режимы отжига.

Рисунок 4: Определение метилирования генов MLH1, N33, CDH1, RASSF1A и DAPK методом МЧ-ПЦР

Определено метилирование гена N33 у пациента №9.

2.4.3.