ПРИЛОЖЕНИЯ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ (ФГУ "ВГНКИ")

УТВЕРЖДАЮ:

Директор ФГУ ВГНКИ ветпрепаратов, академик РАСХН

_________________________________________________ А.Н.Панин

«____________________________________ »______________ 2007 г.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по диагностике микозов животных, вызываемых

грибами рода Malassezia

РАССМОТРЕНО:

На методической комиссии По препаратам против

___________ инфекций

председатель комиссии, профессор

___________ В .И. Смоленский

« »__________________ 2007 г.

Разработчики: сотрудники отдела качества и стандартизации

лекарственных средств против микозов и микотоксикозов животных: зав. отд., к.в.н. Маноян М.Г., к.б.н. Овчинников Р.С., аспирант Ершов П.П.

Москва 2007 г.

1. Общие положения

1.1. Настоящие методические рекомендации устанавливают метод ди­агностики микозов животных, вызываемых грибами рода Malassezia, в усло­виях ветеринарных лабораторий.

1.2. Возбудителем заболевания являются липофильные дрожжевые грибы рода Malassezia. Основной возбудитель - вид М. pachydermatis, реже диагностируются виды М. sympodialis, М. globosa и др. Грибы рода Malassezia являются представителями нормальной микрофлоры кожного по­крова и слизистых оболочек животных. В условиях воздействия факторов, снижающих резистентность макроорганизма, популяция грибов многократно увеличивается, что приводит к развитию патологического процесса.

Malassezia-инфекции зарегистрированы у большинства видов домашних животных, повсеместно распространены. Протекают как правило в форме поражений слухового канала (отитов), в форме кожных поражений (дермати­тов), реже - как поражения когтей, органов зрения (конъюнктивиты) и др. Течение заболевания как правило хроническое (от нескольких месяцев до не­скольких лет), устойчиво к лечению антибиотиками.

1.3. Метод основан на выделении из патологического материала куль­тур грибов рода Malassezia при посеве на питательные среды, их идентифи­кации и количественном учете выросших колоний гриба.

1.4. Цель метода - выявление грибов рода Malassezia в очаге поражения и оценка плотности их популяции, выраженной в колониеобразующих еди­ницах (КОЕ). Плотность популяции гриба рода Malassezia, превышающая нормальные значения, дает основания для утверждения его этиологической роли.

2. Материалы, оборудование и инструменты

- тампон-зонд в стерильном коллекторе с транспортной средой Эймса (например, производства Eurotubo (Испания) или аналогичный)

- или тампон-зонд в стерильном сухом коллекторе или пробирке;

- чашки Петри стерильные (стеклянные или пластиковые);

- диски, импрегнированные антифунгальными препаратами (например, произовдства HiMedia (Индия) или аналогичные);

- термостат, обеспечивающий нагрев до 370С;

- микроскоп световой микробиологический;

- предметные и покровные стекла для микроскопа;

- спиртовая или газовая горелка;

- микологический крючок или бактериологическая петля;

- трафарет окружности (диметр 20 мм);

- тубус металлический для трахеотомии.

Питательные среды.

Сусло-агар. Для приготовления сусло-агара используют неохмеленное пивное сусло с кислотностью 1,9-2,3 по Тернеру. Сусло подвергают дробной стерилизации текучим паром в течение трех дней по 30 мин. ежедневно. Пивное сусло разводят водопроводной водой до содержания углеводов по Баллингу 7-80, устанавливают pH до стерилизации 7,0-7,4, добавляют 2,5- 3,0% агар-агара, кипятят до растворения агара, фильтруют через ватно­марлевый фильтр, разливают в стерильную посуду. Стерилизуют 40 мин. при 0,5-0,8 атм. После стерилизации pH сусло-агара должен составлять 6,3-6,8.

Среда Сабуро (состав г/л)

Пептон ферментативный - 10 г

Агар-агар - 20 г

Глюкоза-20 г.

Вода водопроводная - до 1 л pH после стерилизации - 5,4-5,8

Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 110-112С и давлении 0,5 Мпа в течение 20 минут.

Среда Барфатини (липид-содержащая)

В 1 литр расплавленной среды Сабуро добавляют 20 см3 подогретого оливкового масла и 2 см3 твин-80.

Селективные добавки:

Хлорамфеникол (производства Oxoid (Великобритания) или аналогич­ная).

Перед использованиеу питательные среды расплавляют на водяной ба­не и после их охлаждения до 45-50°С в среду Сабуро (или сусло-агар) вносят селективную антибактериальную добавку в соответствии с инструкцией из­готовителя. Среду Барфатини используют без селективных добавок. Пита­тельные среды тщательно перемешивают, разливают в чашки Петри и дают остыть на ровной горизонтальной поверхности. Слой среды в чашках должен быть не менее 0,5 см.

3. Сбор анамнестических и клинических данных

3.1. На животное, поступившее на амбулаторный прием с клинически выраженными кожными поражениями (дерматитами) или поражениями на­ружного слухового прохода составляют карту, отражающую следующие све­дения:

- вид животного, порода, пол, возраст, условия содержания, рацион;

- наличие в истории болезни инфекционных, паразитарных и незараз­ных заболеваний (обращая особенное внимание на пищевые аллергии, ато­пические дерматиты, гормональные патологии, паразитарные заболевания кожи);

- использование при лечении антибиотиков, гормональных препаратов;

3.2. При описании клинической картины при поражениях слухового канала (отитах) учитывается:

- течение (острое / хроническое);

- локализация (односторонняя / двухсторонняя);

- характер экссудата (гнойный / церуминозный / жировой;

- наличие гиперемии, мацерации, гиперкератоза, лихенизации;

наличие зуда, расчесов, самотравмирования;

Клиническая картина Malassezia-отита представлена на рис. 41, 42.

При описании клинической картины при поражениях кожи (дермати­тах) учитывается:

- течение (острое / хроническое);

- локализация, площадь поражения;

- наличие и характер экссудата;

- наличие гиперемии, лихенизции, мацерации, гиперкератоза;

- образование комедонов;

- изменения пигментации кожи;

- наличие зуда, расчесов, самотравмирования;

Клиническая картина Malassezia -дерматита представлена на рис.

4. Отбор и транспортировка проб патологического материала

4.1. За 5-7 дней до отбора пробы прекращают медикаментозную обра­ботку мест поражений животного (если она проводилась).

4.2. Перед отбором пробы из кожных поражений проводят выстригание волос до высоты не более 1 мм.

4.3. При локализации поражения в слуховом канале стерильный там­пон-зонд вводят в слуховой канал через стерильный металлический тубус, проворачивают тампон вокруг своей оси на 360 градусов, извлекают и поме­щают в коллектор с транспортной средой или пробирку (рис. 45).

4.4. При отборе проб из кожных поражений после предварительной об­работки на место отбора пробы накладывают обеззараженный трафарет ок­ружности с внутренним диаметром 20 мм и двумя-тремя круговыми движе­ниями выполняют мазок стерильным тампоном-зондом (рис. 46).

4.5. Транспортировка, хранение образцов патматериала до начала лабо­раторного микологического исследования:

- в сухом коллекторе или пробирке - срок хранения образцов не более 2 сут. при 5-80 С;

- в коллекторе с транспортной средой - не более 7 сут. при 5-80С.

5. Проведение лабораторного микологического исследования

5.1. Посев образцов патматериала проводят на следующие питательные среды в чашках Петри:

а) среда Барфатини;

б) среда Сабуро (или сусло-агар) с добавлением хлорамфеникола или другой антибактериальной селективной добавки.

Посев проводят с соблюдением правил асептики, вблизи пламени го­релки, методом штриха, по 6 штрихов на чашку. Используют минимум две чашки каждой среды.

5.2. Культивирование посевов проводят в термостате в аэробных усло­виях в течение 3-5 сут. при 37°С.

5.3. Учет результатов посевов:

5.3.1. Определяют наличие роста колоний грибов рода Malassezia на основании макро- и микроморфологических признаков. На среде Барфатини наблюдают рост кремовых или желто-коричневых колоний, слегка морщини­стых, матовых, края ровные или слабо-фестончатые, обратная сторона коло­ний светло-коричневая.

На сусло-агаре (или среде Сабуро) с хлорамфениколом колонии выпук­лые, желто-коричневые, гладкие, матовые, края ровные, обратная сторона колоний светло-коричневая, диаметр колоний 2-4 мм. Зона помутнения сре­ды вокруг колоний не образуется (рис.48).

При микроскопии культур наблюдают дрожжевые клетки, одиночные и в скоплениях, почкующиеся, почкование однополярное, перкуррентное. По форме почкующиеся клетки напоминают «отпечаток стопы» или «земляной орех». Ширина дочерней клетки может быть меньше или равна материнской. Размер клеток 3-6х2-3 мкм. Псевдомицелий не образуется (рис. 49).

5.3.2. Проводят подсчет колоний грибов рода Malassezia на среде Бар­фатини (при отсутствии контаминации, затрудняющей подсчет). При нали­чии контаминации на среде Барфатини подсчет колоний проводят на сусло- агаре с хлорамфениколом. При дальнейшей оценке плотности популяции гриба учитывают, что жизнеспособность грибов рода Malassezia на данной среде в среднем в 2,5 раза ниже, нежели на среде Барфатини.

5.3.3. Оценку плотности популяции грибов рода Malassezia проводят по результатам учета колоний на среде Барфатини:

а) При росте единичных колоний Malassezia spp. (до 10 КОЕ в образце) плотность популяции оценивают как низкую, не имеющую клинического значения. Результат анализа отрицательный;

б) При росте более 20 КОЕ в образце плотность популяции оценивают как аномально высокую, имеющую клиническое значение. Результат анализа положительный;

в) При росте 10-20 КОЕ в образце результат оценивают как сомнитель­ный, оценку клинической роли проводят с осторожностью, учитывая сово­купность других клинических данных.

5.3.4. Видовая идентификация выделенного гриба рода Malassezia.

а) При наличии роста колоний как на липид-содержащей среде Барфа­тини, так и на среде без липидов (сусло-агаре или агаре Сабуро), вид иден­тифицируют как М. pachydermatis (основной возбудитель Malassezia- инфекций, не являющийся липди-зависимым);

б) При наличии роста колоний на среде Барфатини и отсутствии роста на среде без липидов изолят гриба рода Malassezia оценивается как липид- зависимый, его видовую идентификацию при необходимости проводят в специализированной ветеринарной микологической лаборатории на основа­нии изучения физиологических свойств.

5.3.5.

6. Определение чувствительности выделенной культуры гриба рода Malassezia к антифунгальным препаратам

Проводят диско-диффузионным методом, используя диски, импрегни­рованные следующими антифунгальными препаратами:

- нистатин (используется для местной терапии);

- клотримазол (используется для местной терапии);

- кетоконазол (используется для местной и системной терапии);

- итраконазол (используется для системной терапии);

- флуконазол (используется для системной терапии).

Степень чувствительности культуры к каждому из препаратов оцени­вают по диаметру зоны задержки роста культуры вокруг диска, в соответст­вии с инструкцией изготовителя дисков. Препарат, проявивший наибольшую антифунгальную активность в отношении выделенного изолята Malassezia spp., целесообразно рекомендовать для дальнейшей терапии Malassezia - инфекции.

Рис. 41. Клиническая картина Malassezia-отита у собаки (гиперемия, ко­ричневые пастообразные выделения)

Рис. 42. Клиническая картина Malassezia-отита у собаки (гиперемия, темно-коричневые крошащиеся выделения)

Рис. 43. Клиническая картина Malassezia-дерматита у собаки с локали зацией в области губ, глаз

Рис. 44. Malassezia-дерматит у собаки с локализацией в области свода стопы и межпальцевых пространств

Рис. 46. Отбор пробы патологического материала из кожных поражений

Рис. 47. Морфология колоний М. pachydermatis и образование зон преци­питации на среде Барфатини

Рис. 48. Морфология колоний Л/, pachydermatis на сусло-агаре с добавле­нием хлорамфеникола

Рис. 49. Микроморфология М. pachydermatis. Почкующиеся дрожжевые клетки в форме «отпечатка стопы»