2.7 Индикация бактерий рода «Протеус»

2.7.1.Порядок проведения исследования.

2.7.2 Первый день исследования. 50г корма помещают в колбу с 500 мл стерильного физиологического раствора или 0,1% стерильной пептонной воды и тщательно встряхивают на шуттель-аппарате в течение 30 мин.

2.7.3 Второй день исследования. Просматривают титрационные посевы на скошенном МПА или ТТХ- агаре. Если регистрируют «ползучий» нежный вуалеобразный рост на МПА или нежно-розовый (на ТТХ-агаре), то определяют по наименьшему количеству засеянного материала, в котором обнаруживают бактерии рода «Протеус».

2.7.4 Просматривают чашки с посевами и отмечают колонии, подходящие дальнейшему исследованию. На среде Плоскирева бактерии растут в виде прозрачных колоний, зона роста которых окрашивается в желтоватый цвет; на висмут-сульфит агаре через 24 ч. Выбирают изолированные колонии темно-коричневого цвета, окраска среды просматривается. Если рост 18-24 часовой культуры однородный, то для дальнейшего изучения используют не менее 4-х колоний, при росте различных колоний - не менее шести;

2.7.5 Для определения родовой принадлежности изучаемого штамма изолированные колонии отвивают в пробирку с МПБ, из которого после 4-5 часовой инкубации при 37° С производят пересев на следующие среды:

- агар с фенилаланином для определения фермента фенилаланиндезаминазы;

- бульон или пептонную воду для определения индола;

- среду с мочевиной для определения фермента уреазы;

- среду с 0,5% мальтозы;

- скошенный агар или ТТХ-агар для серологического типирования и определения патогенности.

Среды помещают в термостат при 37°С на 16-18 часов. Наличие фермента фенилаланиндезаминазы определяют путем наслоения на скошенную поверхность среды 4-5 капель 10%-ного раствора хлорного железа. Появление интенсивной зеленой окраски свидетельствует о наличие фермента.

Гидролиз мочевины (наличие фермента уреазы) устанавливают по изменению цвета среды из желтого в красный. Индол определяют на МПБ по специальным индикаторным бумажкам, вложенным под пробирки. Индол можно определять путем наслоения на среду реактива Эрлиха (0,5мл), при этом появление красного кольца на границе жидкостей через 2-5 минут свидетельствует о положительном результате.

2.7.6 Третий день исследования.

2.7.6.1 Микроскопическое исследование. Протеусы морфологически представляют собой прямее грамотрицательные подвижные палочки длиной 1-3 мкм, шириной 0.4-0,8 мкм, встречаются нитевидные формы. Протеусы не образует капсул и спор.

Наличие фермента фенилаланиндезаминазы определяют путем наслоения на скошенную поверхность среды 4-5 капель 10%-ного раствора хлорного железа. Появление интенсивной окраски свидетельствует о наличии фермента.

Грамотрицательные бактерии, гидролизующие мочевину, дезаминирующие фенилаланиндезаминазу, относят к роду Рroteus. Штаммы, ферментирующие мальтозу и образующие индол, относят к Р. vulgaris; штаммы, не ферментирующие мальтозу и не образующие индол относят к Р. mirabilis.

2.7.6.2 Серологическое исследование. Штаммы, отнесенные по основным биохимическим свойствам к роду Рroteus, подвергают серологическому типированию при помощи диагностических поливалентных и типовых (О- и Н- сывороток в РА на стекле). Для типирования используют суточную агаровую культуру. При нечетких результатах, полученных в РА на стекле с живой культурой, проводят РА в пробирках или на стекле с прогретой (1 час – 100 ^oС), отцентрифугированной культурой. Серологический вариант определяют в соответствии со схемой Кауфмана и Перча.

2.7.6.3 Патогенные свойства бактерии рода «Протеус» определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. С этой целью заражают не менее трех мышей массой 16-18 г смывом суточной агаровой культуры или суточной бульонной культурой в дозе 500 млн. микробных клеток по стандарту мутности. Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей впервые двое суток после заражения.