2.2 Методы исследования

Клинико-лабораторное исследование пациенток проводилось с помощью инструментальных методов диагностики (УЗИ, допплерография, КТГ в динамике); лабораторное обследование включало общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, исследование параметров системы гемостаза (подробно описаны ниже).

Осуществлялся контроль биохимических показателей анализа крови, количество форменных элементов (для исключения анемии, тромбоцитопении). С целью исследования системы гемостаза забор крови производился сухой стерильной иглой из локтевой вены в пластиковую пробирку в соотношении с антикоагулянтом 9:1. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия. Необходимая обработка и выполнение срочных тестов проводились в течение 2 часов после взятия крови. Для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 минут. Для приготовления бестромбоцитной плазмы кровь центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 минут.

Исследование системы гемостаза включало:

-Оценку показателей коагулограммы: активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового индекса (ПИ), тромбинового времени, уровня фибриногена по Клаусу, уровня АТ III.

-Определение количества тромбоцитов в периферической крови (автоматический счетчик «ТгошЬосоипІег», Франция).

-Оценку гемостазиограммы, которая включала:

Тромбоэластографию: r+k (хронометрический показатель), ma (максимальная амплитуда) ИТП (индекс тромбодинамического потенциала)

(тромбоэластограф «Hellige», Германия)

Определение агрегации тромбоцитов с АДФ и ристомицином (агрегометр Рау ton (США) по методу Вогп)

Определение уровней D-димера полуколичественным методом (латекс-тест Dimertest, Agen, Австралия)

Определение растворимых комплексов мономеров фибрина (РКМФ)

Определение уровня гомоцистеина в крови (иммуноферментный метод с использованием реактивов Axis® фирмы Axis-Shield AS, Норвегия на приборе ANΓOS 2020, США).

Определение глобальной функции протеина С (коагулометрический метод с использованием коммерческих наборов «Парус»-тест фирмы «Технология- Стандарт», Барнаул, Россия на приборе «START 4», Stago, Франция)

Диагностику антифосфолипидного синдрома, которая включала

определение:

Антифосфолипидных антител (иммуноферментный метод, Stago,

Asserachrom APA)

Волчаночного антикоагулянта (ВА)

Кофакторов антифосфолипидных антител:

Антител к бета-2 гликопротеину I

Антител к протромбину

Антител к аннексину V

Определение ВА включало 3 этапа:

1) скрининговые методы осуществлялись с помощью следующих фосфолипид- зависимых тестов:

- АЧТВ с низким содержанием фосфолипидов (РТТ - LA; STAGO, Франция).

- время разведенного яда гадюки Рассела (Stago, Франция; dRVVT)

- протромбиновое время с разведенным тромбопластином (TTI, STAGO, Франция).

Если фосфолипид-зависимые тесты были нормальными, то скрининговая пробf на выявление ВА считалась отрицательной. Удлинение фосфолипид- зависимых тестов (одного или нескольких) диктовало необходимость проведения коррекционной пробы.

2) коррекционная проба осуществлялась путем смешивания исследуемой плазмы с нормальной плазмой в соотношении 1:1; 1:4 и 4:1 соответственно с целью исключения дефицита факторов.

Если при добавлении нормальной плазмы фосфолипид-зависимые тесты оставались удлиненными, проводились тесты, подтверждающие направленность циркулирующих ингибиторов против фосфолипидов. 3) подтверждающая проба - для этой цели использовались лизаты тромбоцитов (PNP, STAGO, Франция) и гексагональный фосфолипид (Staclot, Stago, Франция).

Укорочение АЧТВ до нормы свидетельствовало об антифосфолипидной природе циркулирующих ингибиторов. На четвертом этапе в ряде случаев проводилось дифференцирование других причин нарушения свертываемости

крови - дефициты отдельных факторов и другие специфические антикоагулянты.

Определение генетических форм тромбофилии, генетических

полиморфизмов компонентов системы гемостаза:

Мутация MTHFR C677T

Мутация FV Leiden

Мутация протромбина G20210A

Полиморфизм 675 4G/5G в гене PAI-1

Полиморфизм 163G/T в гене А-субъединицы фактора XIII

Полиморфизм I/D в гене t-PA Полиморфизм в гене XII фактора (фактора Хагемана) 46C/T

Полиморфизм -455G/A в гене фибриногена

Полиморфизм 807C/T в гене гликопротеина GpIa тромбоцитов

Полиморфизм 1565T/C в гене гликопротеина GpIIIa тромбоцитов Полиморфизм 434C/T (HPA-2A/2B) в гене гликопротеина GpIba Полиморфизм 1166 А/C в гене рецептора ангиотензина II 1-го типа (АТGR1) Полиморфизм I/D в гене АПФ

Для установления диагноза тромбофилии использовали критерии, разработанные международной комиссией на конференции в Израиле (Air Travel and Health, Эилат, Израиль, 9-12 ноября 2006 г.) в составе Макацария А.Д., Бицадзе В.О. и Brenner B:

Наличие антифосфолипидных антител, мутации FV Leiden, протромбина G20210A, гипергомоцистеинемии, их комбинаций

≥3 гомозиготных генетических полиморфизма

≥5 гетерозиготных генетических полиморфизма

Для диагностики антифосфолипидного синдрома использовали последние критерии Miyakis S. 2006 г. [181]:

Венозный или артериальный тромбоз (1 и более)

Акушерские осложнения:

Гибель морфологически нормального плода при сроке беременности >10 недель

Преждевременные роды (< 34 недель беременности)

Тяжелые формы гестоза

Плацентарная недостаточность

Три и более выкидыша при сроке беременности до 10 недель (при отсутствии гормональных и анатомических причин, хромосомных аномалий)

Лабораторные критерии:

Волчаночный антикоагулянт

Антитела к кардиолипину

Антитела к бета2-гликопротеину I

Обследование на генетические формы тромбофилии проводилось однократно. Определение уровней гомоцистеина и АФА выполнялось по показаниям, например, для оценки эффекта лечения, при ухудшении состояния матери и плода, появлении новых симптомов, позволяющих заподозрить начало ПЭ, при впервые выявленном АФС для подтверждения диагноза.

Статистическая обработка

Статическая обработка данных проводилась с использованием программы IBM® SPSS® Statistics Версия 19. Использовались следующие критерии: средние величины и стандартные отклонения, двусторонний критерий Стьюдента для сравнения количественных признаков, критерий хи-квадрат для сравнения качественных признаков в двух и более группах, точный критерий Фишера для сравнения качественных признаков между двумя группами при n