ГЛАВА 31. ВИРУСЫ ОСПЫ

Семейство вирусов оспы (Poxviridae)подразделяется на два подсемейства — вирусы оспы хордовых (Chordopoxvirinae) и оспы насекомых (Entomopoxvirinae).В первом подсемей­стве выделены 6 родов вирусов: Orthopoxvirus(оспы), Para­poxvirus(паравакцины), Avipoxvirus(оспы птиц), Capripox­virus(оспы овец), Leporipoxvirus(миксомы) и Suipoxvirus (оспы свиней).

Морфология вирионов оспы настолько характерна у пред­ставителей обоих подсемейств, что не было смысла подразде­лять представителей, поражающих столь отдаленных филоге­нетически «хозяев», на таксономические группы более высоко­го ранга. Вирионы поксвирусов имеют овальную или кйрпи- чеобразную форму с соотношением длин осей 1,2—1,7. Их раз­мер 140—170?220—450 нм, эта величина приближается к размеру наиболее мелких бактерий (риккетсии, хламидии, ми­коплазмы). Строение их не укладывается в рамки типов сим­метрии других вирусов и отличается деталями у представи­телей разных родов. Общим для всех вирусов данного семей­ства является наличие сердцевины в виде вогнутой линии, внешней оболочки и боковых тел, как бы сплющивающих серд­цевину (нуклеоид).

Нуклеоид содержит ДНК, ассоциированную с белками.

Геном вирионов представляет собой линейную двунитевую ДНК с молекулярной массой 85?10⁶—250?10⁶, концы кото­рой соединены ковалентно, образуя терминальные петли и инвертированные тандемные повторы. Молекулярная масса генома не может служить таксономическим признаком, так как у серологически родственных вирусов она колеблется от 85?10⁶(вирус паравакцины) до 200?10⁶(вирус оспы птиц). Содержание Г+Ц у вирусов оспы позвоночных составляет 5— 7,5% от массы вириона; состав нуклеотидов: А —29,5%, Ц — 20%, Г — 20,6%, T — 29,9%. Геном вируса осповакцины со­держит всего 240 000 пар нуклеотидов и имеет длину 82 мкм. Необычная прочность ДНК этого вируса и других вирусов данной группы обусловлена ковалентными связями компле­ментарных нитей на обоих концах молекулы ДНК, примерно на расстоянии 50 нуклеотидов от ее концов [см. Слепуш- кин A. H., 1982]. Как было показано при изучении вируса оспо­вакцины, ее ДНК, подобно ДНК многих других вирусов, со­держит терминальные инвертированные повторы, которые, как предполагается, играют важную' роль в репликации ДНК. У вируса осповакцины эти повторы весьма велики — молеку­лярная масса около 7?10⁶, или около 10 000 пар нуклеотидов. Они могут быть частично транскрибированы, кодируя синтез ранних мРНК [Wittek R. et al., 1980].

На геноме вирусов оспы закодировано несколько сотен бел­ков (глико- и фосфопротеидов) с молекулярной массой 80 000— -200 000. По данным разных авторов, для различных вирусов число вирусспецифйческих белков варьирует.

Из нескольких (около 10) больших антигенов вирионов ■один перекрестно реагирует со всеми «членами» вирусов оспы •позвоночных. В пределах родов серологические связи разных вирусов выражены еще больше. На ранних стадиях репродук­ции вируса осповакцины синтезируется белок с молекулярной массой 19 000, сходный с фактором эмбрионального роста кле­ток млекопитающих (о возможном значении и происхождении этого белка см. ниже). В связи со сложными процессами син­теза и созревания вирусных белков и морфогенезом вирионов антигенная структура внутриклеточного и внеклеточного ви­русов различна.

Репликация вирусов оспы (рис. 61) происходит в цитоплаз­ме ступенчато, включая первичное раздевание (uncoatingI), «синтез ранних мРНК и белков, вторичное раздевание (uncoa­tingII), репликацию ДНК, синтез поздних мРНК и-белков, входящих в состав вирионов, их гликозилирование и фосфо­рилирование, образование предшественников вирионов, созре- .

Хотя имеются данные об участии клеточного ядра в репро-

■ дукции вирусов оспы [Miningan H. et al., 1985], но оно не

Рис. 61. Цикл репликации вируса осповакцины (схема).

обязательно, так как весь цикл репродукции вирусов оспы можно воспроизвести в безъядерных клетках [Villareal Е. et al., 1984]. Вместе с тем репродукция этих вирусов, если даже абсолютно исключить клеточно-зависимые синтезы бел­ка, тесно связана с клеточным метаболизмом. Об этом свиде­тельствуют возможность репродукции штаммов вируса ocπσ- вакцины, дефектных по некоторым генам (например, по гену тимидинкиназы), возможность замены этого гена геном гер­песвируса, а также наличие в геноме вируса достаточно об­ширных нереплицирующихся областей. Именно на использо­вании последних в значительной мере основаны генно-инже­нерные исследования, в результате которых вирус осповакци­ны со встроенными в него чужеродными генами становится экспрессирующим их вектором (см. ниже).

После адсорбции вирионов на клеточных мембранах и про­никновения их в клетку вместе с образовавшимися эндоцитоз.- ными вакуолями происходят слияние клеточных и вирусных мембран, первичная депротеинизация вирионов и высвобож­дение сердцевин (нуклеоидов), которые после этой первой стадии раздевания становятся метаболически активными. Син­тез ранних мРНК, образование кэп-структур и полиаденили­рование обеспечиваются вирионными ферментами, при этом не происходит сплайсинга [Venkatesan S., Moss В., 1981]. Регу­лирующие области генов вирусов оспы имеют богатые адени­ном и тимином (TATAA) последовательности, но в остальном

отличаются от генов про- и эукариотов. В ранних стадиях транскрибируется 14% генома, и из ранних белков синтезиру­ются тимидинкиназа, эндонуклеазы и другие ферменты виру­са, а также «родственный белок». Таким образом, депротеини­зация вириона включает две стадии: клеточно-зависимую, обеспечивающую удаление внешних оболочек, и вирусзависи- мую, обеспечивающую более полную депротеинизацию ДНК и возможность ее репликации.

Места, в которых происходят репликация ДНК и формиро­вание вирионов, являются структурами клеточной цитоплаз­мы, модифицированными вирусом; их обозначают как вирус­ные фабрики. Более 100 белков, синтезирующихся в первые часы инфекции, обеспечивают вторую стадию раздевания, реп­ликацию вирусной ДНК и транскрипцию поздних генов. Среди ферментов, синтезируемых в этой стадии, следует назвать ти- мидинкиназу, ДНК-полимеразу, полинуклеотидлигазу, фер­менты синтеза ДНК.

Репликация вирусной ДНК связана с образованием раз­рывов терминальных петель, самопраймированием З'-концов; вирусной ДНК, но в общем многие детали синтеза вирусной ДНК мало изучены, и поэтому предлойсено несколько схем ее репликации. Поздняя транскрипция охватывает большую часты генома. На этой стадии транслируются структурные белки,, входящие в состав вирионов. Подсчитано, что ¹A генома виру­сов оспы кодирует ранние, ¹A — структурные и ¹A — поздние неструктурные белки [Pennington T., 1976]. В транскрипции поздних генов, по-видимому, участвует клеточная РНК-поли- мераза II. Часть белков, синтезируемых на этой стадии, под­вергается протеолитическому расщеплению, которое связано; со сборкой вирионов и их предшественников.

Сборка вирионов происходит в «вирусных фабриках» и яв­ляется многоступенчатым процессом. Сначала дочерняя ДНК ассоциируется с внутренними белками, образуются плотные нити и гранулы. Затем формируется оболочка вирионов в виде гладкой стенки, охватывающей электронно-плотный материал,, и образовавшиеся незрелые вирионы (провирионы) выглядят в виде пузырей, в которых формируются нуклеоиды (сердце­вины) и боковые тела. Происходят уплотнение внутреннего- материала и оболочек и образование поверхностных структур, в результате чего формируются зрелые вирионы. Вирионы вы­водятся из клетки по каналам внутриклеточного транспорта, а часть их освобождается после гибели зараженных клеток.

Вирусы оспы вызывают глубокое угнетение синтеза клеточ­ных макромолекул, причем эти синтезы блокируются как ви­рионными белками, так и белками, синтезирующимися в ходе репродукции вируса.

неопластическую трансформацию (вирусы фибромы, Яба, кон­тагиозный вирус моллюска). Для вирусов оспы характерны такие генетические процессы, как рекомбинация внутри родов, ■спасение маркера [Nakano Е. et al., 1982] и негенетическая ,реактивация между родами вируров оспы позвоночных. Виру­сы оспы, циркулирующие в природе, подвергаются процессам рекомбинации. Одним из таких рекомбинантов является зло­качественный вирус кроликов, явившийся рекомбинантом 10% ■генома вируса фибромы кроликов и 90% генома вируса мик­сомы кроликов [Block W. et al., 1985].

Более подробно описание особенностей генетики вирусов •оспы можно найти в монографиях и обзорах [см. Гендон Ю. 3., 1975]. Здесь же мы хотели бы отметить некоторые важные особенности, характерные, впрочем, не только для вирусов оспы, но и для других, ранее упоминавшихся ДНК-оодержа- -щих вирусов (герпесвирусы, бакуловирусы, аденовирусы и др.). Во-первых, ДНК вирусов оспы, близких между собой, или му­тантов, легко рекомбинируются, образуя как гомологичные, так и гетерологичные рекомбинанты. В последнем случае об­разующиеся гетеро дуплексы могут включать в себя чужерод­ные гены. Во-вторых, рекомбинация может происходить не только между полными геномами двух вирусов оспы, но и между полным геномом и сравнительно небольшим его фраг­ментом (4?10^δ), включенными в плазмиду, при чкотрасфекции. В-третьих, в геноме вирусов оспы имеются большие участки, ■которые условно обозначают как несущественные для репли­кации области генома. Они имеют размер около 25 000 пар .нуклеотидов, т. е. более 10% всего генома [Smith G., Moss. B., 1983]. По-видимому, этой областью кодируется синтез белков репликации и других, которые могут быть заменены клеточ­ными белками, как например, тимидинкиназа, а может быть, и белки, обеспечивающие вирулентность вируса. Все эти осо­бенности делают вирус осповакцины весьма удобным вектором для включения в него чужеродных генов. Мы не будем здесь цитировать уже многочисленную литературу, посвященную использованию вируса осповакцины для генно-инженерных операций; сошлемся лишь на меморандум экспертов ВОЗ по этому вопросу [WHO, 1985]. Важно подчеркнуть другое: при .генно-инженерных операциях, т. е. искусственных манипуля- щиях, используют естественные существующие генетические .взаимосвязи у этой и других групп вирусов.

Котати, именно эта особенность вирусов оспы послужила ^препятствием для применения ,рекомбинантного вируса оспо­вакцины, содержащего экспрессируемый ген протективного .гликопротеида вируса бешенства, для иммунизации лисиц. При поедании мяса, смоченного суспензией такого вируса, у лисиц :и других хищников развивается осповакцинный стоматит, со­

провождающийся выработкой иммунитета одновременно про­тив осповакцины и бешенства. Однако комитет экспертов ВОЗ решительно возразил против такого проекта, намечавшегося к проведению в Аргентине. Имелась в виду опасность появле­ния в природе рекомбинантов вирусов оспы с повышенной нейровирулецтностью, которая вызвана или связана с геном вируса бешенства, введенного в ДНК вируса осповакцины.

Вирусы оспы вызывают разнообразные заболевания, и все же наиболее выраженно они проявляются в виде высыпаний на коже и слизистых оболочках. Соответственно у животных заболевания передаются при контакте, через корм и питье, а у человека также воздушно-капельным путем. Особое место занимают неопластические процессы, поражающие либо на­ружные покровы, либо более глубоко лежащие ткани (фибро­ма). В последнем случае возможно участие в передаче крово­сосущих насекомых.

Громадная величина генома, сопоставимая с величиной ге­нома у наиболее мелких бактерий (микоплазмы, риккетсии и особенно хламидии), автономность процессов репликации и транскрипции, обеспечиваемая вирусспецифическими фермен­тами, отсутствие сплайсинга — все это позволяет поставить одновременно два вопроса. Закономерно ли считать вирусы оспы вирусами? Не являются ли они продуктами дегенератив­ной приспособительной эволюции бактерий, причем даже ме­нее далекими, нежели органеллы типа пластид и митохонд­рий? В самом деле, наиболее мелкие бактерии — хламидии — настолько деградировали эволюционно, что утратили собст­венные энергорегенерирующие системы и стали своеобразны­ми энергетическимIj паразитами. По биологическим свойствам от вирусов оспы они-отличаются «только» наличием рибосом­ных белоксинтезирующих систем. Однако это «только» и яв­ляется разделом между вирусами и клеточными формами жизни, поэтому пока нет веских оснований исключать вирусы оспы из царства вирусов.

К сожалению, еще не сделана проверка эволюционных со­отношений вируса оспы с прокариотами (эукариотами и/или архебактериями),. так как все эти проверки, построение фило­генетических древ и т. п. делались чаще всего на основе ана­лиза рибосомных PHK (26S, 16S, 55). Последние имеются даже у потомков далеко эволюционировавших эндосимбион­тов (митохондрии, пластиды). А этого как раз и нет у оспен­ных вирусов.

Кроме того, несмотря на большую автономию генома виру­сов оспы от генома клеток «хозяев»-эукариотов, включая про­цессы репликации вирусной ДНК, имеются факты, свидетель­ствующие о генетических взаимодействиях между вирусами оспы и их «хозяевами». Так, при исследовании белка с моле-

Рис. 62. Эволюционное древо белка вируса осповакцины сходных доменов у млекопитающих. Обведенные пунктиром овалы обозначают неопределен­ность ветвей древа.

кулярной массой 19 000, синтезируемого на ранних стадиях репродукции вируса осповакцины, было показано необычное положение цистеиновых и глициновых остатков в молекуле этого белка, сходное с положением этих остатков в двух кле­точных белках — трансформирующем факторе роста (TGF)и факторе эпидермального роста (EGF).Эти два белка, обла­дающие сходными функциями и близкие по величине (50 и 53 аминокислотных остатков соответственно), стимулируют мута­генез. Первый обнаружен во многих опухолях и в эмбрио­нальных тканях, второй — в подчелюстной железе и моче людей. Было высказано предположение, что все 3 белка и некоторые другие белки животных [Blomquist М. et al., 1984} имеют общее происхождение, было даже построено их эволю­ционное древо (рис. 62). Указанные 3 белка не имеют имму­

нологического родства, но обладают сходной функциональной активностью. Белок вируса осповакцины, обладающий свой­ствами факторов роста клеток, является ранним секретируе­мым (неструктурным) белком, функции которого пока неиз­вестны.

C геномами эукариотических клеток геномы оспенных ви­русов сближает наличие тандемных повторов в инвертиро­ванных терминальных повторах, что было показано при изу­чении вируса осповакцины. Предполагают, что они облегчают циклизацию однонитевых ДНК во время репликации. Эти по­вторы имеют размеры 70—150 пар нуклеотидов и повторяют­ся тандемно 13—30 раз [Wittek R., Moss В., 1980].

Таким образом, происхождение вирусов оспы остается не­ясным. C бактериями его сближают громадный геном, неза­висимая от клетки репликация и отсутствие сплайсинга. Од­нако структура их генома сходна и со структурой генома эука­риотов, а некоторые гены имеют явно эукариотическое проис­хождение, если не считать их результатом далеко зашедшей молекулярной конвергенции.

Несмотря на большое сходство плана строения и морфо­логии вирионов оспы позвоночных и оспы насекомых, наличие по крайней мере 4 ферментов с одинаковыми функциями, раз­множение в цитоплазме и ряд других свойств, указывающих на общность происхождения обеих групп вирусов оспы, в эво­люции всей группы вирусов остается много неясного. По-види­мому, более древнее происхождение имеют вирусы оспы насе­комых уж по одному тому, что насекомые — гораздо более древние формы организмов, нежели теплокровные позвоноч­ные. Вирусы оспы не обнаружены у морских беспозвоночных, и если это факт,, а не недостаток знаний, то можно предполо­жить, что вирусы оспы появились не ранее силура, т. е. около 400 млн лет назад, или еще позже, в карбоне.

Освоение ими новой экологической ниши можно связать с развитием кровососущих насекомых, так как некоторые ви­русы оспы позвоночных до сих пор могут передаваться крово­сосущими насекомыми. Кстати, все до сих пор известные ви­русы оспы позвоночных поражают теплокровных — млекопи­тающих или птиц, а вирусы насекомых — как некровососущих (чешуекрылые), так и кровососущих (двукрылые), в том чис­ле комаров-кровососов теплокровных животных. Поэтому об­разование вирусов оспы позвоночных следует отнести к срав­нительно позднему периоду — юрскому или меловому, т. е. 120—150 млн лет назад или еще позже. Именно этим можно объяснить умеренную дивергенцию, существующую между 6 группами (родами) вирусов оспы позвоночных, вплоть до сохранения общих антигенов и еще более широких антиген­ных связей между вирусами одного и того же рода.

! I

Эволюция этих вирусов происходила путем заполнений ⁱ ими новых экологических ниш. Она сопровождалась затем, узкой специализацией вплоть до поражения соответствующим, вирусом только одного вида. Так появились и эволюциониро­вали вирусы оспы буйволов, верблюдов, кроликов, мышей (группа вирусов осповакцины), узелков доильщиц, контагиоз­ной эктимы, пустулярного стоматита коров (группа вирусов, паравакцины), оспы канареек, голубей, перепелок, ласточек,, воробьев, индюшек (группа вирусов оспы птиц), оспы овец,, коз, фибромы и миксомы кроликов, оспы свиней. Приручение- человеком животных, с одной стороны, усилило специализа­цию вирусов (оспа овец, коз, верблюдов), с другой — интенси­фицировало распространение вирусов, в результате чего одни и те же виды домашних животных стали поражаться разными вирусами оспы. Например, коровы поражаются вирусами оспо- вакцины, коровьей оспы, пара-вакцины, узелков доильщиц; кролики — вирусами кроличьей оспы, фибромы и миксомы. Впрочем, вопрос об узкой специализации не столь уж прост. Мы говорим о