Болезнь Альцгеймера и генетический скрининг новых мишеней для разработки терапевтических препаратов

Болезнь Альцгеймера (БА) характеризуется прогрессирующим снижением когнитивных функций, в первую очередь памяти, а также развитием поведенческих расстройств (Иллариошкин, 2003). Это заболевание является наиболее частой причиной деменции в пожилом и старческом возрасте.

В протеолитический процессинг АРР, ведущий к образованию Ар, вовлечены Р-секретаза (трансмембранная гликозил-аспартил-протеаза), получившая название BACE, и у-секретаза, представляющая собой сложный белковый комплекс, основным компонентом которого являются трансмембранные белки пресенилин 1 (PSN1) или пресенилин 2 (PSN2) (DeStrooper, Annaert, 2000). Все известные на сегодняшний день семейные формы БА связаны с мутациями в генах АРР, PSNl, PSN2 (Selkoe, 1999).

Appl характеризуется высокой степенью гомологии с АРР, подвергается аналогичному протеолитическому расщеплению, но не содержит последовательности, необходимой для генерации Ар (Luo et al., 1990; Rosen et al., 1989). Выключение Appl не приводило к летальному эффекту, но вызывало значительное изменение поведенческих реакций, которые восстанавливались при экспрессии АРР, что говорит о функциональном консерватизме между Appl Drosophila и АРР человека (Luo et al., 1992). Целый ряд исследований указывает на ключевую роль Appl в формировании и поддержании синапсов у Drosophila (Ashley et al., 2005; Torroja et al., 1999b). Эксперименты по определению локализации Appl показали значительное обогащение Appl в растущих аксонах и синаптических структурах, а также участие Appl в образовании и дифференцировке синапсов в нейромышечных контактах личинок (Torroja et al., 1999b). Гиперэкспрессия как Appl, так и АРР человека вызывала нарушение аксонного транспорта (Gunawardena, Goldstein, 2001; Torroja et al., 1999a). При гиперэкспрессии АРР человека в Drosophila melanogaster он также транспортировался в пресинаптический терминал нейронов и постсинаптические участки нейромышечных контактов (Yagi et al., 2000).

При моделировании БА на Drosophila melanogaster наиболее часто используют прямую экспрессию последовательности Ар (Iijima-Ando, Iijima, 2010; Moloney et al., 2010) в Drosophila. Так А. Финелли с коллегами были получены линии дрозофилы, в тканях нервной системы которых экспрессировались последовательности Ар, кодирующие пептиды разной длины (соответственно АР_1-40 и АР_1-42) (Finelli et al., 2004). У мух, несущих в геноме последовательность более амилоидогенного АР₁ были выявлены диффузные амилоидные отложения и гибель нейронов. Эти

нейропатологические процессы сопровождались прогрессирующими с возрастом дефектами в поведении, а также сокращением продолжительности жизни.

Для определения эффектов на синаптические функции эндогенно синтезируемого АР_1-42 его последовательность была экспрессирована в моторных нейронах и мышечных клетках личинок Drosophila. Оказалось, что образование АР₁₄₂ по- разному влияло на синаптические функции в зависимости от типа клеток. Так, в нейронах, по мнению авторов, АР₁₄₂ главным образом был представлен в виде олигомеров, приводя к уменьшению амплитуды возбуждающих токов и не влияя на долговременную депрессию (ДВД), в то время как для мышечных клеток было характерно образование агрегатов большого размера, возможно фибрилл, и увеличение амплитуды возбуждающих токов и ДВД (Chiang et al., 2009). Применение вортамина, специфического ингибитора PI3 киназы, снижало ДВД до нормального уровня. Ингибирование PI3 киназы также улучшало способность к запоминанию, уменьшало количество АР₁₄₂ фибрилл в мозге мух, в то время как количество олигомеров уменьшалось незначительно (Chiang et al., 2010).

В другой работе нарушение синаптических функций, вызванное образованием AP₁₄₂ в нейромышечных контактах имаго, сопровождалось прогрессирующим с возрастом уменьшением пресинаптических и аксонных митохондрий, уменьшением их скорости перемещения по аксону. Причем значительное уменьшение числа пресинаптических митохондрий предшествовало наблюдаемым изменениям в синаптической трансмиссии и ультрасктруктуре синапсов. Экспрессия последовательности Арс мутацией Arctic (AP_arc) значительно усиливала наблюдаемые фенотипы (Zhao et al., 2010).

Нарушение транспорта и распределения митохондрий, снижение уровня белков митохондрий, которое отмечается в мозге больных БА, предполагает, что разрушение функций митохондрий является одним из компонентов или механизмов патогенеза БА (Hirai et al., 2001). Аномальное распределение митохондрий в мозге наблюдалось у мух с экспрессией последовательности АР_1-42: они аккумулировались в нервных клетках, в то время как в аксонах и дендритах их число было редуцировано (Iijima-Ando et al., 2009). Однако сегодня пока трудно сказать, является ли нарушение функций митохондрий ранним проявлением в патогенезе заболевания или это всего лишь последовательное звено в патогенезе БА.

У Drosophila представлены все компоненты белкового комплекса, ответственного за активность у-секретазы, но Р-секретаза Drosophila не разрезает АРР в Р-сайте (Carmine-Simmen et al., 2009), при этом APPL не содержит последовательности Ар, поэтому для полного протеолитического процессинга полноразмерного АРР и повышенной секреции Ар были созданы линии Drosophila, в фоторецепторных клетках глаза которых одновременно были экспрессированы АРР и ВАСЕ человека и мутантные PS1, вызывающие семейные формы БА (Greeve et al., 2004). В рамках этой модели удалось воспроизвести наиболее важные патологические признаки БА, а именно - образование амилоидных отложений и гибель нервных клеток.

В своей работе, выполненной в рамках программы РАН «Фундаментальные науки медицины», мы провели экспрессию АРР и ВАСЕ человека в нервных клетках Drosophila. У мух развивалась прогрессирующая с возрастом нейродегенерация в мозге, нарушение способности к обучению и запоминанию, а также уменьшение плотности синаптических белков в грибовидном теле мозга Drosophila. Интересно, подобные нарушения наблюдались у мух с экспрессией полноразмерного АРР или АРР с мутацией Swedish, независимо от секреции Ap (Sarantseva et al., 2009a,b; Большакова и др., 2013). Следовательно, можно предположить, что мутантный АРР или другие фрагменты его протеолиза могут иметь нейротоксичные свойства.

Исходя из вышеперечисленных биологических особенностей и разработанных генетических методов на Drosophila часто и успешно проводят скрининг генов-модификаторов патологических процессов, что позволяет значительно ускорить проведение исследований и снизить затраты на них. Для скрининга генетических модификаторов амилоидоза были использованы линии мух, экспрессирующие AP₄₂ в фоторецепторных клетках глаза (Finelli et al., 2004). Экспрессия AP₄₂ в глазах мух вызывала ярко выраженный фенотип, характеризующийся дезорганизацией фоторецепторных клеток и уменьшением размера глаз («rough eye»). Для скрининга была использована коллекция из 1963 линий дрозофилы, несущих в геноме вставки ЕР- транспозона. ЕР-транспозон является производным Р-элемента, содержит промотор, активируемый GAL4, и в зависимости от сайта и ориентации инсерции модулирует активность генов. Все линии этой коллекции индивидуально скрещивались с мухами, экспрессирующими Ap. Целью скрининга был поиск линий, в которых наблюдалась модуляция токсического эффекта Ap, маркером которого являлся «rough eye»- фенотип. В результате скрининга фенотипов и последующего ДНК-анализа было выявлено 23 гена модификатора. Среди них - гены, участвующие в различных секреторных процессах, гомеостазе холестерина, а также регулирующие транскрипцию и ремоделирование хроматина. Анализ влияния модифицирующих мутаций на общий уровень Ap и уровень растворимого Ap показал, что восемь мутаций статистически достоверно изменяют общий уровень Ap, при этом в 7 случаях изменения варьировали в пределах 20-30% и только в одной из линий, несущей инсерцию в регуляторной зоне гена неприлизина 2 (nep2), наблюдалось снижение общего уровня Ap на 70% (Cao et al., 2008; Finelli et al., 2004).

В настоящее время показано, что нормальные клеточные функции других белков, участвующих в патогенезе БА, - пресенилинов, не исчерпываются их участием в у-секретазном комплексе и требуют дальнейшего изучения (Baki et al., 2004; Bentahir et al., 2006; Singh et al., 2001; Saura et al., 2004; Schwarzman et al., 1999). Для понимания функций пресенилинов был проведен поиск генетических модификаторов, модулирующих фенотип в крыльях и груди Drosophila, обусловленный гиперэкспрессией пресенилина. Было выявлено 177 модификаторов, среди которых - белки, регулирующие гомеостаз кальция, ответ организма на стресс и упаковку белков, а также компоненты сигнальной трансдукции, апоптотические факторы и белки клеточного цикла. При этом 58 модификаторов взаимодействовали также с АРР. Наличие среди них белков, регулирующих гомеостаз кальция (Calmodulin, sarcoplasmic calciumbinding protein, Ryanodine receptor), указывает на связь между пресенелинами, АРР и регуляцией кальция и предполагает, что она может играть важную роль в патогенезе БА (Van de Hoef et al., 2009).

3.