А. Фосфорорганические соединения: химизм действия.
Еще
в самом начале изучения этих соединений было замечено, что у лиц, работающих с соединениями типа дифлоса (13.26), возможны одышка, повышенная чувствительность к свету, временная потеря сознания и обратимая потеря зрения [Lange, Kreuger, 1932; Schrader, 1963].
Указанное действие фосфорорганических соединений предположительно связывали с ингибированием АХЭ[10]. Изучение фосфорилирования фермента с применением радиоактивного изотопа 32Р, интенсивного источника ^-частиц с периодом полураспада 14 дней, показало, что дифлос (0,0-дии- зопропилфторфосфат) (13.26) ацилирует гидроксигруппу остатка серина в ферменте, являющуюся каталитическим сайтом для АХ. При этом происходит отщепление фтористого водорода [Schaffer, May, Summerson, 1954]. При гидролизе фосфорилиро- ванного фермента выделяется О,О-диизопропилфосфорилсерин.Дифлос использовали для снижения внутриглазного давления при глаукоме, но в настоящее время для этой цели созданы новые, менее токсичные лекарственные препараты.
Действие органических фосфатов изучали также на примере параоксона (13.25), представляющего собой активную форму препарата паратиона (13.24) [Gage, 1953]. Параоксон подобно дифлосу фосфорилирует гидроксигруппу серина, при этом выделяется пара-нитрофенол [Hartley, Kilby, 1952]. На основании этих исследований был сделан вывод, что в АХЭ существует только один каталитический активный участок—• гидроксигруппа серина. Однако субстрату АХЭ равно необходим второй активный участок, связывание субстрата с которым вызывает конформационные изменения фермента, способствующие каталитическому действию активного центра [O’Brien, 1971]. Предполагают, что есть три типа таких «вторичных» активных центров: первый — для АХЭ и тетраэтиламмониевых солей, второй — для фосфорорганических соединений и третий —для карбаматов. Таким образом, «вторичный» активный центр (см.
модель рецептора на рис. 12.3) является не анионным, а липофильным.Кинетические исследования показали, что фосфорорганические соединения и фермент сначала образуют переходный комплекс, характеризующийся константой аффинности К [Aldridge, 1950; Main, 1964]. В результате фосфорилирования фермента этот комплекс распадается и выталкивает уходящую группу. Характеристикой этого практически необратимого процесса служит кр — константа фосфорилирования (или инактивации). Значения К и кр определены для многих фосфорорганических соединений и АХЭ, выделенных из разных источников.
Эти кинетические исследования послужили основой для изучения связи структура — активность. Например, для ряда аналогов параоксона (13.25) при изменении алкоксигрупп (от метокси до бутокси) и варьировании электроноакцепторных заместителей в бензольном кольце было установлено, что ни алкоксигруппы, ни природа уходящей группы не влияют на величину кр. Это справедливо и в случае изменения четырех алкильных заместителей в молекуле малаоксона (13.27). Однако значения К для производных параоксона в 2—10 раз выше, чем для малаоксона. По-видимому, вышеуказанные изменения химической структуры могут изменять сродство к ферменту, но не влиять на фосфорилирующую активность [Chiu, Main, Dau- terman, 1969]. Присутствие в молекуле электроноакцепторных заместителей в уходящей группе способствует повышению анти- холинэстеразной активности до определенного максимума, однако значительное уменьшение прочности связи уходящей группы с остальной частью молекулы приводит к образованию соединений, легко гидролизующихся под действием воды [Aldridge, Barnes, 1952; Aldridge, Davison, 1952]. Ниже этого максимума существует линейная зависимость между логарифмом константы гидролиза и логарифмом константы скорости бимолекуляр-
ной реакции взаимодействия фосфорорганического соединения с ферментом.
Эффективные инсектициды найдены среди эфиров фосфорной, фосфиновой и фосфоновой кислот.
В эфирах фосфиновой кислоты обе алкильные группы присоединены непосредственно к атому фосфора, в эфирах фосфорной кислоты обе присоединены через кислород; эфиры фосфоновой кислоты занимают промежуточное положение.На рис. 13.2 изображены основные процессы, происходящие при фосфорилировании фермента. Если еще не произошло «старения» ингибируемого фермента, то он может быть реактивирован в результате взаимодействия с анионной группой гидро- ксиламина. Явление «старения» было открыто Hobbiger (1955), обнаружившим, что сложные эфиры вторичных спиртов способствуют «старению» в большей степени, чем соответствующие эфиры первичных спиртов. Правильное представление о «старении», как о процессе, скорость которого пропорциональна скорости гидролиза алкоксигруппы, превращающейся при этом в анион, появилось позднее [Berends et al., 1959]. Нечувствительность инактивированного, «постаревшего» фермента к действию антидота обусловлена силами кулоновского отталкивания.
В опытах на насекомых было показано, что под действием фосфорорганических соединений в первый час сильно ингибируется АХЭ и резко возрастает уровень свободного АХ [Small- man, Fiske, 1958]. О действии этих агентов на нервную систему насекомых см. разд. 6.4.1.
Ацетилхолинэстеразы, выделенные из различных видов насекомых, значительно отличаются по чувствительности к фосфорорганическим инсектицидам [R. O’Brien, 1967]. АХЭ у насекомых менее доступна для экзогенных соединений, чем у млекопитающих, поэтому ионизированные аналоги не могут быть использованы в качестве инсектицидов, так как чужеродные ионы не могут проникать через мембрану (разд. 3.2).