12.5. Ацетилхолинэстераза

Хотя АХЭ можно выделить в чистом виде, ее высокая ОММ (320000) сильно затрудняет изучение структуры с помощью дифракции рентгеновских лучей. По данным С-концевого ами­нокислотного анализа в состав фермента входят два различ­ных полипептида с одинаковой ОММ.

АХ (12.65) всегда существует в виде катиона: степень его ионизации не зависит от pH среды. Исследования молекулярно­го механизма гидролиза АХ начались с работы Wilson, Berg­mann (1950), определивших константу диссоциации комплекса АХ — фермент, как равную 2.6ХІ0^-4. Изучая зависимость ско-

¹ Использование теоретического информационного анализа для изучения строения связывающего центра а-адренорецепторов см. в работе: В. А. Говы- рин, Б. С. Жоров. Физиол. журн. СССР им. Сеченова, 1984, т. 70, с. 529— 551. — Примеч. ред.

Рис. 12.3. Активный участок ацетилхолинэстеразы [Wilson, Bergmann 1950; Wilson, 1962] (символ GH обозначает ими­дазольный цикл гистидинового остатка).

роста гидролиза от pH среды^[6], они установили, что этот фер­мент имеет основную группу с рК_а 7,2 (вероятнее всего, имид­азольный цикл остатка гистидина) и кислотную группу с рКа 9,3 (по-видимому, остаток тирозина). Они предположили, что фермент-субстратный комплекс образуется ионной связью между четвертичной аммониевой группой АХ и анионной груп­пой с рКа 9,3 фермента, а также диполь-дипольным взаимодей­ствием атома азота при двойной связи имидазольного цикла (в ферменте) с дробным положительным зарядом атома углерода С=О группы эфира.

Схематическое изображение активного участка АХЭ пока­зано на рис. 12.3 [Wilson, 1962]. С помощью ингибиторов с жесткими молекулами типа цис- и трансизомеров йодида 2-три- метиламмонийциклопентанола было установлено, что расстоя­ние между связывающими местами фермента составляет около 0,25 нм [Friess, Baldridge, 1956].

Позднее было высказано предположение об образовании ковалентной связи между атомом кислорода карбонильной группы ацетилхолина и гидроксильной группы остатка серина. Основанием для этого послужила способность органических фосфатов, например диизопропилфторфосфата (13.26), фосфо- рилировать остаток серина в ферменте на участке с аминокис­лотной последовательностью (Glu-Ser-Ala) [Schaffer, May, Summerson, 1954; см. разд. 9.0]. Был сделан вывод, что аце­тильная группа АХ притягивается к гидроксильной группе се­ринового остатка и ацетилирует ее. Функция имидазольной группы, расположенной на другой складке ферментативного белка, видимо, заключается в облегчении гидролиза ацетилиро- ванной группы серина [Wilson,Cabib, 1956].

После того как было обнаружено, что 3,3-диметилбутилаце- тат (12.66) и АХ одинаково легко гидролизуются АХЭ, стало ясно, что ван-дер-ваальсовы взаимодействия метильных групп (присутствующих в катионной головке АХ) могут играть более важную роль в связывании природного медиатора с ферментом, чем положительный заряд [Whittaker, 1951]. В настоящее вре­мя считают, что «анионное место связывания» в действитель­ности является «липофильным местом связывания», взаимодей­ствующим с высоколипофильной частью молекулы АХ, и не за­висит от ее заряда [O’Brien, 1971].

В отсутствие фермента АХ в холодном водном растворе ус­тойчив в кислой среде, но неустойчив в щелочной при pH более 10,0. Величины констант скорости его гидролиза указывают на то, что заряженный атом азота притягивает атакующие гид­роксильные ионы к соседней сложноэфирной группе; поэтому АХ значительно легче гидролизуется в щелочной среде, чем обычные эфиры, например этилацетат [Butterworth, Eley, Sto­ne, 1953].

На поверхности концевой пластинки мышцы содержится до­статочное количество АХЭ для расщепления 1 млн молекул АХ в 1 мсек, что в тысячу раз превышает число молекул АХ, необходимое для деполяризации концевой пластинки [Nach- mansohn, 1940].

Кроме ингибирования органическими фосфатами и другими ацилирующими агентами (разд. 13.3), АХЭ может обратимо блокироваться и простыми четвертичными аммонийными соеди­нениями. Установлено, что при увеличении размера алкильных групп в бисчетвертичных соединениях повышение сродства (из­меряемое как —AF) на каждую метиленовую группу (СН2) со­ставляет более 300 кал/мол. При данной длине цепи моночет­вертичные ингибиторы связываются сильнее, чем бисчетвертич­ные [Bergmann, Segal, 1954]. Об изучении гидрофобной облас­ти холинэстераз см. Kabachnik и сотр. (1970).

Прекращение действия АХ в сердце бивалентных моллюс­ков, не имеющих АХЭ, осуществляется по иному механизму. Высвобождение АХ из нервных окончаний вызывает выделение из мышцы АТФ-подобного вещества, снижающего чувствитель­ность холинорецептора по аллостерическому механизму. Такой же механизм существует и в сердце высших животных, однако там его перекрывает более эффективное действие АХЭ [Turpa- ev, Sakharov, 1973].