Обсуждение

Дефекты костной ткани, ее возрастная утрата или потеря в связи с патологическими состояниями не могут быть полностью устранены путем физиологической регенерации или посредством хирургического вмешательства.

В таких ситуациях используются биоматериалы или их синтетические аналоги.

Имеющиеся методы далеко не всегда позволяют не только заполнить объем имеющегося дефекта, но и создать условия выполнения механической функции кости. Иными словами, мы приблизились к созданию достаточного объема костной ткани, но структурные характеристики получаемого костного регенерата далеки от желаемого. Возникшую проблему мы и попытались решить в представленном исследовании.

Метод, оказывающий влияние на механизмы ремоделирования костной ткани, связан с использованием рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости (rhBMP-2), который, в свою очередь, активизирует функцию остеобластов. Изучение свойств и возможностей использования rhBMP-2 проводится в настоящее время в большинстве медико- биологических центров мира.

На первом этапе исследования задача состояла в синтезе и получении непосредственно самого белка для планируемых исследований. Эта задача была успешно решена в содружестве с Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН, лаборатория тканевой инженерии, руководитель лаборатории д.ф.-м.н Акатов Владимир Семенович.

Белок был получен методом генной инженерии, который включал следующие этапы:

1. Генноинженерная сборка биологической конструкции;

2. Введение созданной молекулы в клетки бактерии E.Coli;

3. Наработка достаточного объема бактериальной массы для получения необходимого количества белка;

4. Выделение белка из бактериальной массы и его биохимическая очистка.

Проведенный анализ литературных данных позволил оптимально выбрать биоматериал, необходимый для совместного использования с rhBMP-2.

В дальнейшем, получив необходимую композицию (биоматериал с rhBMP-2), мы приступили к лабораторным исследованиям.

В лаборатории стромальной регуляции иммунитета ФГБУ НИИ им. Н.Ф. Гамалеи под руководством д.м.н. проф. Р.К. Чайлахяна был запланирован и успешно проведен эксперимент, целью которого ставилось выявление имеющееся митотической активности клеток-предшественников стромальных фибробластов костного мозга и визуально оценить их адгезивную активность на поверхности предложенного биоматериала, содержащего rhBMP-2.

Клетки-предшественники стромальных фибробластов костного мозга получали следующим методом: крыс усыпляли эфиром. С соблюдением правил асептики через разрез на задней части бедра выделяли бедренные и большеберцовые кости. Эпифизы костей обрезали и шприцом выдували костный мозг во флакон с питательной средой. Фрагменты костного мозга пропускали через шприц с последовательно уменьшающимся диаметром игл при минимальном давлении в нем до получения гомогенной взвеси клеток. Взвесь дважды отмывали центрифугированием при 4°С (400g), осадок ресуспендировали в свежей питательной среде, фильтровали через 4-х слойный капроновый фильтр.

Для получения штаммов стромальных клеток-предшественников костного мозга эксплантировали во флаконы. На 10-14 день культивирования, когда

колонии стромальных фибробластов были полностью сформированы, проводили I пассаж.

Для изучения взаимодействия штаммов остеогенных клеток- предшественников с остеопластическим материалом, насыщенным рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости rhBMP-2, его засеивали пассивированными клетками. Культивирование проводили в течение 5- 7 дней. Затем производили фиксацию.

Перед фиксацией культуральную среду сливали, материал несколько раз промывали физиологическим раствором и на 30 мин.

Визуальная оценка клеток-предшественников на остеопластическом материале с помощью сканирующего электронного микроскопа показала, что наличие rhBMP-2 не препятствует прикреплению и фиксации клеточного материала на недеминерализованном костном матриксе. Данное исследование проводилось в лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ НИИ им. Н.Ф. Гамалеи, руководитель лаборатории – д.м.н. Л.В. Диденко.

После завершения лабораторной части исследования приступили к эксперименту на животных.

Для проведения экспериментальной части нами была разработана экспериментальная модель критического дефекта в своде черепа крысы. Используемая нами экспериментальная модель дефекта, по мнению зарубежных исследователей, является максимально информативной и приближенной к естественным условиям функционирования остеоиндуктивного биоматериала в организме реципиента. Моделирование процесса восполнения дефекта дает возможность исследовать плотность, объем и качество образующегося регенерата и оценить остеоиндуктивные характеристики в цифровых значениях. Так же

исследовалось влияние рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости rhBMP-2 в составе недеминерализованного костного матрикса на процесс костеобразования как в зоне хирургического вмешательства, так и в сегменте в целом.

В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс породы Вистар с массой тела 400-500 г в возрасте 4-5 месяцев. Животные были разделены на 3 группы: I-я - контрольная, II-я – группа сравнения и III-я – экспериментальная (по 18 крыс в каждой). У животных II-ой (экспериментальной) группы дефект заполняли чистым недеминерализованным костным матриксом

«Остеодент», а у III-ей (экспериментальной) группы дефект заполняли недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», содержащим rhBMP-2.

В послеоперационный период животным производили антисептическую обработку раны раствором хлоргексидина 0,05% на первые, третьи, пятые и седьмые сутки. У животных всех групп швы снимали на седьмые сутки после операции. При осмотре отмечали признаки послеоперационных воспалительных явлений и проводили оценку течения раневого процесса на первые, третьи, пятые и седьмые сутки после операции и заносили результат в таблицы. Клиническая картина была оценена по набору клинических признаков, которые оценивали по системе «Да» и «Нет», что соответствовало баллам 1 и 0, и выражали в процентном соотношении.

81

Таблица 8

Частота встречаемости клинических признаков в послеоперационном периоде

На первые сутки разница частоты встречаемости клинических признаков в экспериментальной группе и группе сравнения составила 0,8% в пользу экспериментальной группы.

На третьи сутки составила 3,2% в пользу экспериментальной группы. На пятые сутки составила 0,8% в пользу экспериментальной группы. На седьмые сутки составила 3,2% в пользу экспериментальной группы.

После проведенного анализа полученных данных выраженности клинических проявлений у лабораторных животных после вмешательства статистически значимых различий между группой сравнения и экспериментальной группой выявлено не было. Следовательно, наличие rhBMP-2 в составе костного материала не влияет на степень и течение воспалительного процесса.

Гистологическое исследование образцов свода черепа, включавших область хирургического вмешательства, проводили непосредственно после биопсии. Материал помещали в 10% раствор формалина на фосфатном буфере на 72 часа, после чего в течение 24 часов образцы ткани промывали в проточной воде. Декальцинацию проводили электролитическим способом в перенасыщенном растворе ЭДТА. По завершении процесса образцы ткани промывали в проточной воде в течение 24 часов. Промытые и обсушенные на фильтровальной бумаге кусочки помещали на 24 часа в 50% раствор этанола.

В результате проведенного морфологического исследования установлено, что имплантация материала с rhBMP-2 показывает разницу с группой сравнения в первые 2 срока наблюдения (1 и 2 мес.) в сторону более высокой эффективности образования костной ткани по сравнению с имплантацией материала не содержащего rhBMP-2, а также использованная модель критического дефекта костной ткани является адекватной и отвечает требованию к поставленным целям и задачам (Бычков А.И., 2013).

Исходя из полученных данных компьютерной томографии, выявлены различия между контрольной и опытными группами в пользу последних. Между экспериментальной группой и группой сравнения статистически значимых различий обнаружено не было.

Следовательно, наличие рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости rhBMP-2 в составе остеопластического материала не влияет на площадь восстановленной костной ткани.

Проведенные нами исследования и оценка остеоиндуктивности отечественного рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости rhBMP-2 показало высокую перспективу его клинического использования совместно с различными комбинациями остеопластических материалов.

Адгезия клеточного материала на поверхности остеопластического материала, насыщенного рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости rhBMP-2 доказывает целесообразность применения для заполнения костных дефектов и использования для реконструктивных операций на челюстных костях в ЧЛО.

Данные морфологических исследований изучаемых сегментов позволяет делать вывод о полноценной структуре костного регенерата, образующегося в дефекте. В дальнейшем это позволит полноценно и оптимально использовать данный участок в челюстных костях для различных видов лечения, в том числе и дентальной имплантации.