ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность работы

Муковисцидоз (МВ) – наиболее частое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутацией гена CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), характеризующееся клиническим полиморфизмом [Капранов Н.И.

Учитывая объективные сложности проведения этиотропного лечения, во всем мире активно проводятся исследования, уточняющие патогенетические механизмы заболевания, что позволяет разрабатывать новые направления терапии МВ [Капранов Н.И., Каширская Н.Ю. и др., 2009]. Несмотря на пристальное внимание исследователей к вопросам патогенеза заболевания, остаются неясными механизмы генетических, иммунных и иммунорегуляторных нарушений, способствующих прогрессированию недуга у детей, особенно с учетом характера хронической респираторной инфекции, т.к. индивидуальный ансамбль факторов вирулентности микробных агентов во многом определяет особенности иммунологического ответа и дальнейшего течения заболевания.

Наиболее актуальным, на сегодняшний день, является изучение иммунорегуляторных отношений при сепационной инфекции, которая может приводить к формированию тяжелого, неконтролируемого гнойно-воспалительного процесса в респираторном тракте и гибели больного МВ в течение 2-х лет после инфицирования [Капранов Н.И., Каширская Н.Ю. и др., 2009, Семыкин С.Ю., 2009, Амелина Е.Л., 2008].

Учитывая иммунный генез полиорганного поражения при МВ, дальнейшие перспективы изучения связаны с переводом исследований на молекулярно-генетический уровень, поиском прямых предшественников белков каскада комплемента, цитокиновых молекул и их рецепторов на разных уровнях развития врожденного и приобретенного иммунитета.

Исходя из изложенного, представляется актуальным проведение комплексного исследования генов-модификаторов иммунного ответа, показателей врожденного иммунитета и цитокиновой регуляции с учетом клинической картины и характера микробной колонизации у больных МВ, что позволит прогнозировать дальнейшее течение заболевания, и будет способствовать созданию новых иммунокоррегирующих реабилитационных программ для данной категории больных.

Цель работы: Разработать новые диагностические и прогностические критерии течения муковисцидоза у детей на основе многокомпонентного анализа генетических, микробиологических, иммунорегуляторных и неспецифических факторов.

Задачи исследования

1. Уточнить частоту встречаемости муковисцидоза в Астраханской области по данным неонатального скрининга.

2. Определить клинико-анамнестические особенности течения заболевания и проанализировать частоту вирусных и бактериально-воспалительных заболеваний внелегочной локализации у больных муковисцидозом, в зависимости от тяжести течения заболевания и характера микробной колонизации в бронхиальном дереве.

3. Изучить состояние факторов врожденного иммунитета (уровень лизоцима в мокроте и сыворотке крови, бактерицидную активность сыворотки крови, комплементарного статуса) больных муковисцидозом в зависимости от тяжести, фазы заболевания и микробиологического респираторного статуса .

4.Установить клинико-патогенетическое и диагностическое значение ведущих про- (ИЛ -1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-α, ИФН-γ) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов в сыворотке крови и мокроте у больных муковисцидозом с учетом характера респираторной инфекции и тяжести течения заболевания,.

5. На основании полученных данных о состоянии факторов врожденного иммунитета и регуляторных цитокинов разработать прогностические критерии, определяющие вариант дальнейшего течения заболевания после инфицирования Burkholderia cepacia.

6.Проанализировать частоты полиморфизмов в генах ИФН-γ, ИЛ-4, Rа ИЛ-4 среди больных муковисцидозом и здоровых индивидов.

7.Изучить ассоциации полиморфизмов в указанных генах с течением бронхолегочного процесса и с характером поражения системы пищеварения у больных муковисцидозом.

Научная новизна работы

Впервые проведен комплексный анализ данных микробиологического, генетического и клинико-иммунологического обследования у больных муковисцидозом.

Впервые определена частота встречаемости муковисцидоза по данным неонатального скрининга в Астрахани и Астраханской области.

У больных МВ впервые выявлены существенные различия факторов врожденного иммунитета и цитокиновой регуляции, ассоциированные с характером микробной колонизации бронхиального дерева. Подтверждена важная роль нарушения иммунорегуляторных механизмов (цитокинового звена, показателей врожденного иммунитета) в прогрессировании бронхолегочного процесса у больных МВ. Установлены новые дополнительные дифференциально-диагностические критерии фазы бронхолегочного процесса у больных МВ.

Впервые выявлены достоверные различия в показателях цитокиновой регуляции у больных с фульминантным и стабильным течением заболевания после колонизации бронхиального дерева B. сepacia. На основании проведенного углубленного статистического анализа клинико-анамнестических и лабораторных данных впервые выявлены прогностические факторы, определяющие дальнейшее течение заболевания после заражения Burkholderia cepacia.

Впервые получена оценка частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов ИФНγ, ИЛ-4, ИЛ-4Rа в выборке больных МВ, проживающих на территории Российской Федерации. Проведен анализ связей данных полиморфных локусов с клиническими проявлениями муковисцидоза и выявлены ассоциации с тяжестью бронхолегочной патологии и некоторыми осложнениями МВ, такими как цирроз печени и хроническое легочное сердце. Впервые у больных МВ выявлена ассоциация генотипов Т/С и С/С полиморфизма Т-1488С гена ИФН-γ c более благоприятным развитием бронхолегочного процесса и особенностями поражения желудочно-кишечного тракта.

Впервые показана ассоциация тяжести бронхолегочного процесса у больных МВ с мутантным аллелем C модификации 3’-UTR G/C гена ИЛ-4.

Впервые выявлена ассоциация аллеля I гена ИЛ-4Ra с более тяжелым течением бронхолегочного процесса и формированием хронического легочного сердца у больных МВ.

Впервые установлено, что полиморфизмы Т-1488С гена ИФН-γ и 3’-UTR G/C гена ИЛ-4 являются функционально значимыми и влияют на уровни экспрессии кодируемыхцитокинов.

Практическая значимость

Результаты работы имеют существенное значение для практической медицины, поскольку раскрывают важные патогенетические механизмы муковисцидоза у детей с учетом особенностей хронической респираторной инфекции.

Определение распространенности муковисцидоза в регионе позволяет совершенствовать организационные и методические мероприятия по оказанию медико-социальной помощи данному контингенту больных.

Интерпретация иммунологических показателей, с учетом клинико-анамнестических, микробиологических и лабораторных данных позволяет существенно расширить возможности терапии, определить стратегию иммуномодулирующих воздействий, в частности интерферонсодержащими препаратами и препаратами лизоцима, что будет способствовать уменьшению числа рецидивов и индукции длительной ремиссии. Установлено важное практическое значение определения уровней ИЛ-6, ИЛ-8, С5а, лизоцима в сыворотке крови, БАСК как дополнительных дифференциально-диагностических критериев фазы бронхолегочного процесса и оценки эффективности проводимой терапии у больных с муковисцидозом.

Выявленные особенности цитокиновой регуляции у больных МВ, при различных типах клинических реакций, ассоциированных с колонизацией B. сepacia, позволяют прогнозировать дальнейшее течение заболевания, проводить коррекцию терапии и обеспечить территориально разделение пациентов.

Результаты работы вносят вклад в общее представление о генах-модификаторах клинической картины МВ. Выявленные ассоциации генетических полиморфизмов ИФН-γ (Т-1488С), ИЛ-4 (3’-UTR G/C) и ИЛ-4Rа (I50V) с тяжестью бронхолегочной патологии и рядом осложнений (циррозом печени, хроническим легочным сердцем) у больных МВ позволяют рекомендовать генотипирование больных МВ на наличие неблагоприятных аллелей этих генов для объективизации прогноза течения заболевания и выработки более рациональной тактики лечения.

Положения, выносимые на защиту

1. Тяжесть муковисцидоза и прогноз заболевания определяются вариантом генетической мутации и характером инфекционного процесса, ассоциируемого с видом микробного агента в бронхиальном дереве. Хроническая колонизация респираторного тракта грамотрицательной микрофлорой обуславливает высокую частоту развития как сопутствующей патологии, так и осложнений внелегочной и легочной локализации. Лидирующая позиция в развитии осложнений, принадлежит B.cepacia.

2. У больных МВ наблюдается выраженный дисбаланс факторов врожденного иммунитета: по мере прогрессирования бронхолегочного процесса определяется усиление темпов активации в системе комплемента, снижение активности мурамидазы, изменение активности БАСК, а так же повышение синтеза провоспалительных и противоспалительных цитокинов как в сыворотке крови, так и непосредственно в очаге поражения – респираторном тракте.

3. Степень и выраженность дисбаланса факторов врожденного иммунитета зависит от характера доминирующего инфекционного агента в бронхиальном дереве. Цитокиновый каскад у детей, больных МВ, при колонизации грамотрицательной флорой, отражает чрезмерную активацию моноцитарно-макрофагального звена иммунитета (повышение титров ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8) и Т-хелперов 2 типа (нарастание ИЛ-4, ИЛ-6) на фоне снижения регуляторной значимости ИФН-γ. При воспалительном процессе, ассоциированном со стафилококковой инфекцией, наблюдается более адекватный иммунный ответ с умеренной активностью цитокинового профиля, что обеспечивает сохранность морфологических структур легких и высокие показатели ФВД. У пациентов, с колонизацией респираторного тракта B. cepacia, при фульминантном течении заболевания, в биологических жидкостях резко выражен дисбаланс цитокиновой регуляции по сравнению с пациентами со стабильным клиническим течением, что может быть использовано для прогнозирования дальнейшего течения заболевания.

4. Различия в интенсивности цитокинового ответа обусловлены с одной стороны особенностями хронической респираторной инфекции, с другой – влиянием генов, как CFTR, так и генов-модификаторов иммунного ответа.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на научно-практических конференциях сотрудников АГМА и врачей Астраханской области по актуальным вопросам медицины (Астрахань, 2007, 2008, 2009, 2010г.г.), Астраханской областной научно-практическая конференция «Лекарство и здоровье человека» (Астрахань 2006, 2007, 2008, 2009г.г.), заседаниях Астраханского отделения Союза Педиатров России; XV, XVI, XVII Российских Национальных Конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2009, 2010г.г.), Всероссийском Конгрессе «Новые технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2007г.), VIII и IХ, Х Национальном Конгрессе по муковисцидозу (Ярославль, 2008г., Москва, 2009г.. Ярославль, 2011), конгрессах педиатров России (Москва 2005, 2010г, 2011) на Республиканской научно-практической конференции «Новые технологии в диагностике и лечении болезней органов дыхания у детей и подростков» (Алматы, 2009), на ХIV, ХV международных конгрессах по реабилитации и иммунореабилитации (Дубай, 2009г.,Тель-Авив, 2010г.).

Внедрение в практику

Материалы исследований внедрены в работу пульмонологического отделения МУЗ II Городской детской клинической больницы, ГУЗ ОДКБ им. Н.Н.Силищевой г. Астрахани, МУЗ VII Городской детской клинической больницы г. Волгограда. Полученные в результате исследования данные включены в лекционный материал, используются на практических занятиях со студентами, интернами, клиническими ординаторами и курсантами факультета постдипломного образования Астраханской государственной медицинской академии, включены в методические рекомендации и руководства для врачей.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 50 работ, с том числе 12 в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, выпущена 1 монография, 1 учебно-методическое пособие, подана заявка на изобретение (№2010150417(072777) приоритетная справка от 08.12.2010г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста. Работа включает следующие разделы: введение, литературный обзор, материалы и методы исследования, 7 глав собственных наблюдений, обсуждение полученных данных, выводы, практические рекомендации. Список литературы включает 312 источников, из них 101 отечественный и 211 зарубежных. Работа иллюстрирована 54 таблицами и 29 рисунками.