VII. ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение №1

Цитомега стрип

Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для определения IgG антител против цитомегаловируса в сыворотке человека

содержание набора:

1.

2. Моноклональные антитела против IgG человека, меченные пероксидазой хрена – 2 фл. (по 2 дозы).

3. Контрольная положительная сыворотка человека, содержащая IgG антитела к ЦМВ, лиофилизированная (4 дозы) – 1 фл.

4. Контрольная отрицательная сыворотка человека, лиофилизированная (4 дозы) – 1 фл.

5. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ), смесь солей (по 2 дозы) – 2 фл.

6. Цитратно-фосфатный буфер (по 2 дозы) – 2 фл.

7. Перекись водорода, 33% – 1 фл.

8. Твин 20 – 1 фл.

9. Ортофенилендиамин (ОФД) – навеска (4 флакона).

10. Бычий сывороточный альбумин – 2 фл. (по 2 дозы)

Примечание Комплектация набора предусматривает четыре независимые постановки с использованием для каждой из них 5-ти стрипов по 8 лунок, что позволяет исследовать 6 сывороток в 3-х разведениях или скрининг 18-ти сывороток. ВВЕДЕНИЕ

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) – распространенное вирусное заболевание с многообразными клиническими проявлениями. Велика роль ЦМВ в возникновении тяжёлых рецидивирующих пневмоний. Особенно часто ЦМВ поражает иммунологически ослабленных больных. Такое состояние может быть связано с использованием иммуносупрессорных препаратов пи пересадке органов, при злокачественных опухолях, при туберкулёзе лёгких, а также при СПИДе. Особенно тяжело ЦМВ протекает у лиц подвергшихся облучению и находившихся в экологически неблагоприятных зонах, а также у лиц, не обеспеченных полноценным питанием. Цитомегаловирус длительно сохраняется в лейкоцитах, что приводит к опасности развития этой инфекции у реципиента крови.

НАЗНАЧЕНИЕ

Тест-система предназначена для выявления антител к цитомегаловирусу в сыворотках крови больных людей с подозрением на ЦМВ, у доноров и при проведении эпидемиологических исследований. Набор позволяет происследовать в скрининге 72 сыворотки или провести 24 анализа с титрованными сыворотками. В клинической практике необходимо проводить обследование сывороток в динамике.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Тест для выявления антител класса IgG к цитомегаловирусу основан на непрямом иммуноферментном анализе на твёрдой фазе с использованием пероксидазы хрена в качестве маркерного фермента. Анализ состоит из следующих этапов:

1. Исследуемую сыворотку крови человека добавляют в лунку стрипа с адсорбированными на её поверхности антигенами ЦМВ. Если в сыворотке содержатся IgG-антитела, они связываются с этими антигенами.

2. Сыворотку удаляют отмывкой и в лунку добавляют конъюгат моноклональных антител против IgG-человека, меченный пероксидазой, который взаимодействует с иммобилизованными в лунках IgG-антителами к антигенам ЦМВ.

3. Лунки промывают и добавляют ортофенилендиамин (ОФД). В результате взаимодействия ОФД с пероксидазой, соединённой с антителами и фиксированной на стенках лунок, раствор приобретает жёлтую окраску. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна содержанию антител к антигенам ЦМВ в сыворотке.

ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ К РАБОТЕ

Раствор № 1 (ФСБ – Твин 20)

Содержимое флакона № 7 растворяют в 50 мл дистиллированной воды (ФСБ).

Из флакона № 10 добавляют 125 мкл, тщательно размешивают.

Раствор № 1 применяется:

а) для разведения контрольных сывороток;

б) для разведения исследуемых сывороток.

Для промывания лунок планшетов использовать физиологический раствор с Твин-20. 2,5 мл содержимого флакона № 10 растворяют 1 л физ. раствора.

Хранение до 1 недели при 4˚С.

Раствор № 2 (цитратно-фосфатный буфер фл. № 8). Хранить при 4˚С.

Раствор № 3 (раствор ортофенилендиамина).

Готовится непосредственно перед использованием.

Раствор № 4 (р-р бычьего сывороточного альбумина, 1 %)

Содержимое флакона № 12 растворяют в 10 мл р-ра № 1 и разливают в 2 флакона по 5 мл, один из которых хранят при - 20˚С.

Раствор № 5 (р-р серной кислоты 1,8 М)

10 мл концентрированной H2SO4 добавляют к 90 мл дистиллированной воды.

ПРОВЕДЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

1. Контрольные сыворотки, положительную (К⁺) и отрицательную (К^ˉ) разводят каждую в 4 флакона для хранения при температуре - 20˚С или в морозильной камере бытового холодильника не дольше 4-х недель. Для исследования готовят рабочий раствор (1:200), добавляя в одну порцию (0,1 мл) 0.5 мл раствора № 1 и вносят по 100 мкл в лунки с ЦМВ (К⁺- А1 ,А2, А3 и В1, В2, В3) и и с контрольным антигеном (К^ˉ – С1, С2, С3 и D1, D2, D3).

2. Анализируемую сыворотку исследуют в разведениях 1:200, 1:1600, 1:3200. Сыворотку разводят раствором № 1 (ФСБ с Твином-20) и вносят по 100 мкл каждого разведения в лунки с ЦМВ и контрольным антигеном. Контрольные и анализируемые сыворотки в рабочем разведении и хранению не подлежат!

3. Планшет закрывают крышкой и инкубируют 2 часа при 37˚С или 18 час. при комнатной температуре.

4. Лунки отмывают физ. раствором, добавляя по 200 мкл на лунку и сменяя его через 2-3 минуты (4 раза).

5. Конъюгат (флакон № 3) разводят добавлением 5 мл раствора № 4 и вносят по 100 мкл на лунку. Инкубируют 2 часа при 37˚С. Контроль коньюгата, как и контроль фона ставить на стрипах не нужно, т.к. это делается при приготовлении тест-систем и при проверке ОТК.

6. Отмывают, как указано в п. 4.

NB! ВСЕ РАСТВОРЫ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ПРОГРЕТЬ ДО 37˚С.

7. Добавляют по 100 мкл раствора № 3 (ОФД с H₂O₂), планшет закрывают крышкой и инкубируют в темноте при комнатной температуре до появления окраски в положительном контроле (5–10 минут).

Реакцию останавливают добавлением 50 мкл раствора № 5 (р-р H₂SO₄) и определяют степень окрашивания.

УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты реакции учитывают фотометрически при длине волны 492 нм.

Предварительно оценивают качество реакции. Реакция считается качественной при:

, где

Р_АГ – среднее значение оптической плотности положительного контроля в лунках с ЦМВ-антигеном,

Р_К – среднее значение оптической плотности положительного контроля в лунках с контрольным антигеном,

0_АГ – среднее значение оптической плотности отрицательного контроля в лунках с ЦМВ-антигеном,

0_К – среднее значение оптической плотности отрицательного контроля в лунках с контрольным антигеном.

Сыворотка считается положительной если,

S_АГ-S_К ≥ 0,5 х (Р_АГ-Р_К+ 0_АГ+0_К), где

S_АГ – значение оптической плотности, тестируемой сыворотки в лунке с ЦМВ-антигеном,

SK – значение оптической плотности, тестируемой сыворотки в лунке с контрольным антигеном.

После учёта результатов вся посуда, планшеты, наконечники помещают в 6% раствор перекиси водорода на 6-18 часов для обеззараживания.

ФОРМА ВЫПУСКА

Тест-система «ЦИТОМЕГА СТРИП» выпускается в виде упакованного в коробку набора.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ Хранить при температуре 4˚С. Допускается транспортирование всеми видами транспорта при температуре от 0˚С до 26˚.

Срок годности – 6 мес.

Приложение №2

Цитомега тест

Иммунофлюоресцентный диагностикум (РИФ)

для выявления антител к цитомегаловирусу

ИНСТРУКЦИЯ

В набор для определения антител к ЦМВ входит:

1.

2. 1 флакон с контрольной сывороткой, содержащей антитела класса М. Разводят в 100 мкл физиологического раствора (фл. № 4).

3. 1 флакон с контрольной сывороткой, содержащей антитела класса G. Разводят в 100 мкл физиологического раствора (фл. № 5).

4. 1 флакон с контрольной сывороткой, не содержащей антитела к ЦМВ. Разводят в 100 мкл физиологического раствора (фл. № 6).

5. 1 флакон анти-человеческой кроличьей сыворотки (анти-IgG), меченной ФИТЦ (разводят в 0,1 мл физ. раствора, получая исходное разведение, далее доводят его до рабочего разведения).

6. 1 флакон анти-человеческой кроличьей сыворотки (анти-IgМ), меченной ФИТЦ (разводят в 0,1 мл физ. раствора, получая исходное разведение, далее доводят его до рабочего разведения).

7. 1 флакон бычьего альбумина, меченного родамином (разводят в 0,1 мл физ. раствора, получая исходное разведение, далее доводят его до рабочего разведения).

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ

1. Исследуемые сыворотки на наличие антител класса М титруют, начиная с 1:10 до 1:40 и наносят 5 мкл на лунки 1-4 рядов.

2. Исследуемые сыворотки на наличие антител класса G титруют, начиная с 1:20 до 1:80 и наносят 5 мкл на лунки 1-4 рядов.

3. Контрольные сыворотки вносят по 5 мкл также в лунки 5 и К рядов. 1 2 3 4 5 6

+ - положительный контроль

– - отрицательный контроль

1-5 – лунки адсорбированные клетками, инфицированными ЦМВ.

К – лунки адсорбированными нормальными клетками (не инфицированными вирусом).

4. Инкубация 30 мин. при 37˚С во влажной камере.

5. Отмывка 3 раза физиологическим раствором по 5 минут.

6. Стёкла подсушить.

7. Нанести смесь (анти-человеческая кроличья сыворотка, меченная ФИТЦ, и альбумин, меченный родамином). Приготовление смеси см. на далее.

8. Контакт 30 мин. при 37˚С во влажной камере.

9. Отмывка 3 раза физиологическим раствором по 5 мин.

Диагностический титр антител IgG – 1:20; IgM – 1:10.

УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты реакции оцениваются по формуле:

, где

А – % несветящихся клеток в контрольном препарате;

В – % несветящихся клеток в опытном препарате.

Реакция считается положительной, если ИФ≥0,2.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СМЕСИ

160 мкл препарата необходимо для обработки одного стекла.

Приложение №3

ПневмоцистоСкрин

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ IgM И IgG АНТИТЕЛ ПРОТИВ АНТИГЕНА P. CARINII В СЫВОРОТКЕ ЧЕЛОВЕКА

СОДЕРЖАНИЕ НАБОРА

1. Планшет полистироловый с адсорбированным антигеном P. carinii (разборный, 12 х 8) 2 шт.

2. Моноклональные антитела к IgM человека, меченные пероксидазой хрена (концентрат конъюгата антител к IgM) – 0,1 мл 1 фл.

3. Моноклональные антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена (концентрат конъюгата антител к IgG) – 0,1 мл 1 фл.

4. Контрольная сыворотка человека, положительная, содержащая антитела класса IgМ к P. carinii, лиофилизированная. Положительный контроль (К1+) – 0,16 мл 1 фл.

5. Контрольная сыворотка человека, положительная, содержащая антитела класса IgG к P. carinii, лиофилизированная. Положительный контроль (К2+) – 0,16 мл 1 фл.

6. Контрольная сыворотка человека, отрицательная, лиофилизированная. Отрицательный контроль (К-) – 0,16 мл 2 фл.

7. Фосфатно-солевой буфер с Твином 20 (ФСБ-Т), концентрат – 12,5 2 фл.

8. Раствор для разведения хромогена – 12 мл 2 фл.

9. Хромоген (ОФД) 2 табл. х 6 мг 1 пр.

10а. Бычий сывороточный альбумин (БСА) – 100 мг (для IgМ) 1 фл.

10б. Бычий сывороточный альбумин (БСА) – 100 мг (для IgG) 1 фл.

11. Инструкция 1 шт.

ВВЕДЕНИЕ

Пневмоцистоз – заболевание, вызываемое P. carinii. Клинические проявления характеризуются тяжёлыми интерстициальными пневмониями, нередко со смертельным исходом. Пневмоцистоз чаще поражает ослабленных детей, стариков и лиц молодого возраста со сниженным иммунным статусом. На распространение этой инфекции влияет экологическая обстановка в регионе, высокий радиационный фон и неполноценное питание с низким содержанием белка.

НАЗНАЧЕНИЕ НАБОРА

Тест-система предназначена для выявления антител к антигену P. carinii в сыворотках крови больных людей с подозрением на пневмоцистоз и у здоровых при проведении эпидемиологических исследований.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Тест для выявления антител классов IgМ и IgG к антигену P. carinii основан на непрямом иммуноферментном анализе на твёрдой фазе с использованием пероксидазы хрена в качестве маркёрного фермента.

Анализ состоит из следующих этапов:

I. Исследуемую сыворотку крови человека добавить в лунку планшета с адсорбированными на её поверхности антигенами P. carinii. Если в сыворотке содержатся IgМ и IgG антитела, они соединяются с этими антигенами.

II. Сыворотку удалить отмывкой и в лунку добавить конъюгаты моноклональных антител против IgМ и IgG человека, меченные пероксидазой, которые взаимодействуют с иммобилизованными в лунках IgМ и IgG антителами к антигену P. carinii.

III. Лунки промыть и добавить хромоген (ОФД). В результате взаимодействия ОФД с пероксидазой, соединённой с антителами и фиксированной на стенках лунок, раствор приобретает жёлтую окраску. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна содержанию антител к антигену P. carinii в сыворотке.

ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ К РАБОТЕ

Раствор 1

Содержимое флакона 7 растворить в 250 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать.

Раствор 1 применяется:

а) для промывки лунок планшетов;

б) для разведения исследуемых сывороток.

Хранение: до 1 недели при 2-6˚С.

Раствор 2

В одном флаконе 8, содержащем 12 мл раствора для разведения хромогена, растворить полностью при активном перемешивании 1 табл. ОФД из флакона 9. Раствор 2 готовится непосредственно перед использованием.

При приготовлении раствора ОФД следует исключить воздействие света (использовать флакон из тёмного стекла или обёрнутый фольгой).

Раствор 3

Содержимое флаконов 10а и 10б растворить в 10 мл раствора 1. Растворы используются для разведения конъюгатов.

Раствор 4

10 мл концентрированной серной кислоты добавить к 90 мл дистиллированной воды, перемешать.

ПРОВЕДЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

1. Положительную и отрицательную контрольную сыворотки развести в 160 мкл раствора 1 и внести по 50 мкл: в лунки А1-А3 положительную сыворотку, в лунки В1-В3 – отрицательную.

2. Анализируемую сыворотку для определения титра антител класса IgG развести в соотношении 1/20, 1/200 и 1/2000 и внести по 50 мкл каждого разведения в лунки с антигеном P. carinii.

3. Планшет закрыть крышкой и инкубировать 18 часов при комнатной температуре.

4. Лунки отмыть раствором 1, заполняя их полностью и выдерживая с раствором 1 не менее 2-3 мин. (4 раза).

5. 100 мкл концентрата конъюгата антител к IgМ (флакон № 2) внести во флакон № 10^а и 100 мкл концентрата конъюгата антител к IgG (флакон № 3) внести во флакон № 10^б , после чего полученные растворы внести по 50 мкл на лунку. Инкубировать 2 часа при 37˚С.

6. Отмыть, как указано в п. 4.

7. Добавить по 50 мкл раствора 2, планшет закрыть крышкой и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 10-30 минут. Внимательно следить за развитием окраски.

8. Реакцию остановить добавлением 50 мкл раствора 4 и определить степень окрашивания.

УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты иммуноферментного анализа регистрировать с помощью ридера, измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 492 нм. Результат учитывать при:

ОПК1+ ОПК2+

__________ ≥ 2.1 и _______ ≥ 2.1, где:

ОПК- ОПК-

ОПК1+ и ОПК2+ – среднее значение оптической плотности положительного контроля;

ОПК- – среднее значение оптической плотности отрицательного контроля.

Сыворотка считается положительной, если:

ОПС ≥ 0.5 (ОПК+ + ОПК-), где:

ОПС – значение оптической плотности тестируемой сыворотки.

ФОРМА ВЫПУСКА

Тест-система «ПневмоцистоСкрин» выпускается в виде упакованного в картонную коробку набора. Один набор рассчитан на проведение анализов: 45 сывороток на IgМ антитела и 30 сывороток на IgG антитела.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ

Хранить при температуре 2÷8˚С. Допускается транспортирование всеми транспорта при температуре не выше 10˚С в условиях, исключающих замораживание.

Срок годности 6 месяцев.

Рекламации на качество тест-системы просьба направлять

ЗАО «НИАРМЕДИК ПЛЮС» 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18.

Тел. (095)190-43-81, (095)190-30-04; факс (095)193-43-50.

Приложение №4

Пневмоцисто тест

иммунофлуоресцентный диагностикум (РИФ)

для выявления антител IgG и IgМ классов

против P.carinii в сыворотке человека

ИНСТРУКЦИЯ

В набор для выявления антител к ЦМВ входит:

1. 4 стекла с 18 лунками, включая контрольные лунки.

2. 2 флакона с положительной контрольной сывороткой: 1 IgG, 1 IgМ (разводят в 100 мкл физ. раствора).

3. 1 флакон с отрицательной контрольной сывороткой (разводят в 100 мкл физ. раствора).

4. 2 флакона с анти-человеческой кроличьей сухой сывороткой, меченой ФИТЦ – против IgG и IgМ (разводят в 0,1 мл физ. раствора, получая исходное разведение, далее доводят его до рабочего).

5. 1 флакон альбумина, меченого родамином. Разводят в 0,1 мл физ. раствора, получая исходное разведение, далее доводят его до рабочего.

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ

1. Исследуемые сыворотки титруют двукратно, начиная с разведения 1:20 и до разведения 1:160, наносят по 5 мкл каждого разведения на все лунки первого ряда и с 1 по 4 второго и третьего рядов.

2. Контрольные сыворотки вносят по 5 мкл так же в лунки 5 и 6 лунки 2 и 3 рядов. 1 2 3 4 5 6

2

3

+ - на лунку наносится положительная контрольная сыворотка.

– - на лунку наносится отрицательная контрольная сыворотка.

3. Инкубация 30 мин. при 37˚С во влажной камере (не допускать высыхания!).

4. Отмывка 3 раза физ. раствором по 5 минут.

5. Стёкла подсушить.

6. Нанести смесь (анти-человеч. крол. сыворотка, меченая ФИТЦ, и альбумин, меченый родамином). Приготовление смеси см. далее.

7. Контакт 30 мин. при 37˚С во влажной камере.

8. Отмывка 3 раза физ. раствором по 5 минут и последний раз дистиллированной водой.

Диагностический титр антител 1:20.

УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты реакции оцениваются по формуле:

, где

А – % несветящихся клеток в контрольном препарате;

В – % несветящихся клеток в опытном препарате.

Реакция считается положительной, если ИФ≥0,2.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СМЕСИ

160 мкл препарата необходимо для обработки одного стекла.

Приложение №5

Пневмоцисто тест

для выявления АГ P.carinii в биологических материалах человека

В набор для выявления пневмоцист входят:

1. 3 стекла по 18 лунок, включая 4 контрольные лунки, адсорбированные пневмоцистой.

2. 3 флакона с положительной контрольной сывороткой: (разводят в 100 мкл физ. раствора).

3. 1 флакон с отрицательной контрольной сывороткой (разводят в 100 мкл физ. раствора).

4. 1 флакон с анти-человеческой кроличьей сухой сывороткой, меченой ФИТЦ. Разводят в 0,1 мл физ. раствора, получая исходное разведение, далее доводят его до рабочего.

5. 1 флакон альбумина, меченого родамином. Разводят в 0,1 мл физ. раствора, получая исходное разведение, далее доводят его до рабочего. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ

1. Осадок мокроты лаважной жидкости после центрифугирования наносится в пустые лунки по 1 (или 2) лунке на одну пробу.

2. Стекло фиксируется холодным ацетоном после высыхания образца.

3. Во все лунки с исследуемым материалом, а также в 2 лунки с Аg⁺ нанести положительную сыворотку по 5 мкл.

4. В последние лунки 5-го и 6-го рядов внести отрицательную сыворотку по 5 мкл.

5. Инкубация 30 мин. при 37˚С во влажной камере.

6. Отмывка три раза в физ. растворе по 5 минут

7. Нанести смесь анти-человеческой кроличьей сыворотки, меченой ФИТЦ, и альбумина, меченого родамином, по 5 мкл в каждую лунку. Приготовление смеси см. далее.

8. Контакт 30 мин. при 37˚С во влажной камере.

9. Отмывка три раза по 5 мин. физ. раствором и последний раз дистиллированной водой.

1 2 3 4 5 6

Ag⁺ – на лунку адсорбированы пневмоцисты;

+ – на лунку наносится положительная контрольная сыворотка;

- – на лунку наносится отрицательная контрольная сыворотка.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СМЕСИ

160 мкл препарата необходимо для обработки одного стекла.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.

Средние многолетние показатели выявления маркеров пневмоцистоза за период 1994 – 2001 гг.