Клинические результаты биотехнологического лечения рубцов.

Ранее работами N.Carver et al. (1993) было установлено, что окклюзионные повязки лучше всего способствует прикреплению к ране и выживанию кератиноцитов, но не позволяют формироваться стратифицированному (зрелому) эпидермису.

Эффективность клеточных технологий на сегодняшний день доказана, но, к сожалению, эти технологии очень дороги, особенно в странах, где не налажено промышленное производство клеточных композиций. Тем не менее, такие страны, как США уже давно наладили индустрию по производству клеточного материала для трансплантации обожженным. В частности, компания BioSurface Technology Inc, начиная с 1989 года, вырастила 37 000 многослойных пластов кератиноцитов, которые были использованы для лечения 240 больных в 79 странах мира (R.Odessey, 1992) при этом 1 см² клеточной культуры стоит около7-8 $ США (111,113, 135, 139).

Технология лечения различных заболеваний и проблем кожи имеет целый ряд отличий, но в основе любого лечения клетками лежит получение качественного клеточного материала и его трансплантация.

Этот процесс состоит из следующих этапов:

- отбор кожи у пострадавших (или у доноров),

-транспортировка лоскутов кожи в биотехнологический центр,

- выделение клеток базального слоя и их размножение,

- наращивание многослойных пластов кератиноцитов (МПК).

-трансплантация клеточных культур.

Основной проблемой при проведении лечения с помощью пересадки многослойных пластов кератиноцитов является необходимость наличия жизнеспособных клеток на всех этапах клеточной трансплантации. Кусочки кожи для выделения аутологичных или аллогенных клеток должны быть максимально тонкими, так как в этом случае их легче разделить, используя механические и ферментативные методы и получить суспензию живых клеток для выращивания. Их можно получать, срезая дерматомом или используя кожу век, крайней плоти, внутренней поверхности плеча. Учитывая, что клетки чувствительны к галогенам (хлор, йод), перекиси водорода, их нельзя использовать при обработке кожи во время взятии материала.

Количественный и качественный выход клеток из кожных лоскутов и эффективность их культивирования зависят также от состояния здоровья и возраста донора. Кроме того, кожные биоптаты должны быть максимально быстро и в соответствующих условиях (среда, температу ра) доставлены в сертифицированнную и акредитованную для этих целей лабораторию.

Для хранения и транспортировки лоскутов кожи могут быть использованы среда Игла или среда 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, среда DMEM с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки и антибиотиков.

В цитологической лаборатории кожный биоптат сначала механически разделяют на мелкие кусочки, затем идет обработка кожных кусочков с помощью ферментов: трипсина, коллагеназы, диспазы и др.

Под действием ферментов происходит разрушение десмосом и кератиноциты высвобождаются в среду в виде отдельных клеток или агрегатов, состоящих из разного количества клеток. Для культивирования используют только базальные кератиноциты, которые выращивают на специальных средах в термостатах, содержащих 5 % СО, в чашках Петри или во флаконах при t=37°C.

Формирование многослойного пласта кератиноцитов, пригодного для пересадки занимает обычно 7-10 дней. Иногда этот срок окзывается больше, что зависит от качества исходного материала (возраста, состояния здоровья донора, правильности взятия материала, качества используемых сред и др.). Если многослойный пласт переростает, то на его поверхности могут оказаться клетки с явлениями апоптоза, непригодные для трансплантации. Чашки Петри, с выращенным в них на раневых покрытиях многослойными пластами кератиноцитов (МПК), доставляются в клинику в специальных контейнерах при температуре не ниже +15° С.

Модифицированная методика Грина по выращиванию МПК

Рис. 12. I - получение кусочка кожи, II - механическое ее измельчение,

III - разделение мелких фрагментов с помощью ферментов для получения суспензии

клеток. IV - посев суспензии клеток на чашки І Іетри с ростковыми средами,

V. VI. VII - рост и размножение клеток и получение многослойного пласта кератиноцитов

В своей работе в качестве раневого покрытия мы использовали многослойный батист, отказавшись от пленок «Полипор», с которыми мы начинали работать в эксперименте с крысами. Таким образом, многослойные пласты кератиноцитов выращивались нами на предварительно обезжиренном и стерильном батисте, хотя он также не является оптимальным раневым покрытием.

Клинические исследования проводились на волонтерах с соблюдением необходимых этических норм: подписания договора и информированного согласия.

1. Применялась культура собственных (аутологичных) и взятых из банка клеток (аллогенных) кератиноцитов.

2. Собственные кератиноциты получали из кусочка кожи, вырезанной с внутренней стороны плеча пациентов.

3. Операция дермабразии рубцов проводилась с помощью термокаустики, ротационных дисков и эрбиевого лазера.

4. Были взяты группы пациентов с нормотрофическими, гипотрофическими и гипертрофическими рубцами.

Технологический процесс по применению клеточных технологий для улучшения вида рубцов кожи состоял из следующих этапов:

1. Отбор пациентов.

2. Разъяснения сути лечения, сроков получения ожидаемых результатов, подписание договора и информированного согласия.

3. Назначение пациентам за 2-3 недели до операции селмевит по 1т. 3 раза в день, цинктерал по 1т. 3 раза в день.

4. Взятия кусочка кожи длиной 2,0 см и шириной 0,7-1,0 см с внутренней поверхности плеча, высоко, практически в нижней части аксиллярной области для получения аутологичных кератиноцитов.

5. В случае отказа пациентов на выделение собственных кератиноцитов из-за возможности получения линейного рубца на внутренней поверхности плеча, клеточный материал брался из банка клеток (аллогенные кератиноциты).

6. Кератиноциты выделялись и выращивались в условиях сертифи­цированной для этого рода работ лаборатории.

7. После получения МПК достаточного для трансплантации на рубцы назначался день операции в клинике, куда привозился в специальных контейнерах материал в чашках Петри.

8. Производилась операция дермабразии рубца, гемостаз, отшлифованная поверхность промывалась стерильным физиологическим раствором, высушивалась, после чего на нее пересаживались МПК на стерильном батисте «клетками вниз». То есть клетки, которые были верхними в МПК оказывались нижними, прилегающими к отшлифованной поверхности (рис. 13).

Рис. 13. Пересадка МПК на отшлифованную поверхность рубца.

М.П.К. - многослойный пласт кератиноцитов. Р.П. -раневое покрытие. К-кератиноциты

9. Сверху накладывалась стерильная пленка, которая фиксировалась к коже эластичным бинтом или эластичным пластырем Omnifix. Вместо пленки можно использовать и индифферентные раневые покрытия, содержащие силикон, например Mepitel, Mepiform, пластины силиконового геля.

Через 5-7 дней пленка или силиконовое покрытие удаляется. К этому времени все кератиноциты должны переползти на отшлифованный рубец и прикрепиться к его поверхности (рис. 14).

Р.С.

Рис. N. Переползание кератиноцитов на отшлифованную раневую поверхность. Р.С.-роговой слой, М.П.К.- многослойный пласт кератиноцитов,

Р.С. - раневое покрытие, Р. - рубец.

11. Влажная среда, созданная под пленкой и силиконовым покрытием этому активно способствует. Батист, остающийся на рубце с этого момента можно пропитывать куриозином или хитозановым гелем. В результате на 2-ой день создается плотная корка, которую, для удобства пациента лучше фиксировать эластичным, воздухопроницаемым пластырем, например Omnifix. Воздухопроницаемая корка позволяет образовавшемуся эпидермису дифференцироваться и превращаться в зрелый.

В зависимости от вида рубца и глубины шлифовки, повязка отторгается через 8-10 дней. Эпидермис в это время имеет на 30-40% больше клеточных слоев, чем в нормальной коже. Базальная мембрана не сформирована. Кератиноциты утолщеного эпидермиса выделяют в рубцовую ткань массу биологически активных молекул (рис.15).

Успех биотехнологического лечения рубцов во многом зависит от способа ухода за ними в послеоперационном периоде. Клеточные культуры являются «нежным» видом раневого покрытия и в ранние сроки после пересадки МПК могут быть легко отслоены от подлежащих тканей. Поэтому пациентам рекомендуется бережно обращаться с рубцом после операции. В течение 8-9 месяцев не тереть и легко обрабатывать холодной кипяченой водой во избежание сдирания тонкого, вновь созданного эпидермиса, который не имеет плотного сцепления с нижележащими тканями.

Рис. 15. У.С.Э-утолщенный слой эпидермиса, Ц- цитокины. Р. - рубец, Б.К. - базальные кератиноциты.

Примечание.

Перед операцией и в процессе дермабразии применение галогенсодержащих антисептиков и окислителей (йодопирон, сульйодопи- рон, йодинол, йодинат, хлоргексидин, перекись водорода) допустимо, перед пересадкой клеток - категорически противопоказано из-за их цитотоксического действия. Токсичными для клеток также являются также метиленовый синий, бриллиантовый зеленый.

Во избежание присоединения инфекции, особенно при работе с гипертрофическими рубцами, возможна обработка операционного поля неомицином сульфатом, полимиксином или гентамицином. Они не оказывают цитотоксического эффекта на кератиноциты.

В результате такого лечения достигается тройной эффект.

1. Выравнивание поверхности рубца.

2. Создание над ним слоя нового эпидермиса, нормальной толщины.

3. Превращение рубцовой ткани в дермоподобную за счет действия, цитокинов, факторов роста и других биологически активных молекул, выделяемыми пересаженными клетками и стимулированными ими кератиноцитами, фибробластами и макрофагами (рис. 16).

Рг/с. 16. Образование дермоподобнон ткани вместо рубна.

С - сосуды. Б.М. - базальная мембрана

Рубец становится менее заметным, более эластичным, в нем появляются поры, пушковые волосы, может восстановиться пигментация за счет наличия в МПК меланоцитов.

Однако все эти положительные моменты в рубце наступают не сразу. В связи с этим необходимо предупреждать пациетов, о том, что процесс трансформации рубцовой ткани в дермоподобную происходит медленно и оптимальный результат такого лечения можно ожидать не ранее чем через 10-14 месяцев. Сразу после отторжения повязок, шлифованные поверхности имеют выраженную полихромность, тем ярче, чем глубже производилась шлифовка. Наименьшие повреждения кожи отмечаются при шлифовке нормотрофических рубцов эрбиевым лазером (10,18). Цвет рубцов и окружающей кожи восстанавливался в сроки от 3 до 8 недель. Несмотря на такие меры предосторожности, иногда возникает послеоперационная гиперпигментация, которая может самостоятельно пройти в течение нескольких месяцев.

Клинические примеры.

Пациентка Р., 44 лет. Обратилась с жалобами на рубец в области верхней губы, образовавшийся в детстве после падения. Рубец беспокоил чисто косметически, вызывая чувство дискомфорта. Общее состояние удовлетворительное. Считает себя здоровой.

St.l. Кожа лица нормальной жирности, тургор хороший. На верхней губе справа имеется линейный, несколько втянутый рубец с заходом на красную кайму, длиной 2,5 см.

Диагноз: Линейный нормотрофический рубец губы.

Фото 34а - до операции.

Взят кусочек кожи с внутренней поверхности плеча. Через 10 дней после взятия материала проведена лазерная оперативная дермабразия рубца с пересадкой МПАлК. Через 5 месяцев после операции сделан татуаж губ с целью восстановления красной каймы. Фото 346 - через 6 месяцев после операции.

Пациентка Л., 17 лет. Обратилась с жалобами на рубцы бедер, которые образовались в результате ожога кипятком в возрасте 3 лет. Общее состояние удовлетворительное. Сопутствующие заболевания отсутствуют.

Ожоговые поверхности лечили с помощью аутодермопластики. Кожу, для пластики брали с задней поверхности бедер. В результате там также образовались рубцы.

St.l. Большая часть площади обоих бедер представляет собой нормотрофический рубец с гипертрофическими тяжам и участками. Местами встречаются зоны с гипотрофическим западением.

Диагноз: Обширные нормо и гипертрофические рубцы бедер с гипертрофическим тяжами.

Фото 35а - до операции.

Взят кусочек кожи с внутренней поверхности плеча. Через 14 дней после взятия материала была проведена многоэтапная операция дермабразии эрбиевым лазером с пересадкой МПАлК. Дермабразия проводилась поэтапно участками площадью 20x20 см.

Фото 356 - через 6 месяцев после операции лазерной оперативной дермабразии (лазером LinLine).

В процессе работы с различного вида рубцами, было обнаружено, что глубокие гипотрофические рубцы значительно хуже поддаются вышеописанному лечению. Углубления в коже остаются, хотя и в смягченном варианте. В связи с этим возникла идея проводить таким пациентам сочетанное лечение - оперативную дермабразию с пересадкой МПК сочетать с заполняющими (-) ткань технологиями, а именно применить так называемый «дермальный эквивалент».

7.3.