2.2.3 Методы исследования

При всех разработанных моделях орального мукозита животных наблюдали ежедневно в течение 30 сут после облучения, ежедневно оценивая общее состояние (двигательную активность и пищевую возбудимость, изменение массы тела) и клиническую картину орального мукозита.

Изучение влияния повреждающих факторов химиолучевой терапии на выраженность воспалительных процессов в слизистой оболочке полости рта белых беспородных крыс проводили с использованием пробы Шиллера-

Писарева, позволяющей оценить интенсивность воспалительного процесса, и показателя кровоточивости десен, а также путем измерения количества десневой (ротовой) жидкости с помощью взвешивания фильтровальной бумаги до и после сорбирования на ней исследуемой жидкости.

Отбор материала для биохимических исследований проводили до химиолучевого воздействия, на 3 и на 15 сут после облучения. Для этого животных подвергали эвтаназии методом декапитации под действием анестетиков, извлекали слизистую оболочку полости рта (в районе языка и щек) с подслизистым мышечным слоем и замораживали в жидком азоте. В гомогенатах слизистой оболочки полости рта и подлежащих мягких тканей определяли продукты перекисного окисления липидов - малоновый диальдегид методом [247] и диеновые конъюгаты с помощью метода [24, 113], а также изучали активность ферментов антиоксидантной системы - супероксиддисмутазы методом [65], каталазы по методу [63] и глутатион- пероксидазы с помощью метода [25].

Получение материала для микробиологических исследований осуществляли при помощи стерильных тампонов. Мазок делали непосредственно с поверхности слизистой оболочки полости рта (языка и десен). Далее тампон помещали в пробирку со стерильным физиологическим раствором (1 мл), из которого в последующем готовили разведения 1:10, 1:100, 1:1000.

Изучение собственной антимикробной активности у Na^SSG-инозина проводили с использованием классического метода серийных разведений в жидкой питательной среде [88]. Антимикробную активность оцениваемого препарата определяли в отношении 3 микроорганизмов разных видов: грамположительных кокков Staphylococcus aureus, грамотрицательных палочек Escherichia coli и Salmonella typhymurium. Оцениваемый препарат готовили для исследования в концентрациях 1000 - 800 - 400 - 200 - 100 - 50 - 25 - 12,5 мкг/мл. Возбудителей стафилококковой инфекции (Staphylococcus aureus), кишечную палочку (Escherichia coli) и палочку генерализованной сальмонеллезной инфекции (Salmonella typhymurium) выращивали на мясо- пептонном бульоне при 37 ⁰C в течение 24 ч. Посевную взвесь микроорганизмов использовали в дальнейших исследованиях в концентрации 10⁶ микробных клеток/мл. Перед исследованием в бактериологические пробирки вносили по 0,1 мл каждого разведения препарата и по 0,1 мл соответствующей посевной взвеси возбудителя. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и помещали в термостат при 37⁰С на 24 ч. По истечении времени инкубации в присутствии трех экспертов производили визуальный учет результатов по наличию или отсутствию роста микроорганизмов в пробирках.

Влияние дисульфидов глутатиона на состояние костномозгового кроветворения лабораторных животных оценивали в методике эндогенного колониеобразования по количеству колоний, выросших на селезенках мышей-самцов BALB/c на 9 сут после облучения в дозе 7,3 Гр.

Об интенсивности пролиферации клеток костного мозга и уровне

-э

биосинтеза ДНК судили по включению Н-тимидина, который вводили внутрибрюшинно из расчета 1 мкКи/г массы тела за 30-40 мин до эвтаназии животных.

Кроме того, стандартными гематологическими методами в костном мозге и периферической крови оценивали содержание клеток различных ростков кроветворения, находящихся на разных стадиях дифференцировки: от бластных форм до клеток функционального пула.

Оценку факторов врожденного иммунитета проводили по динамике уровня антимикробных пептидов (АМП) - кателицидина LL-37 (hCAP18), P- дефензина (hBD-3) и а-дефензина (HNP 1-3) в периферической крови. Содержание АМП определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью диагностических наборов (Hycult Byotechnology, HBt, Нидерланды) согласно прилагаемым инструкциям.

Содержание провоспалительного цитокина IL-1P,

противовоспалительного цитокина IL-4 и эпидермального фактора роста (EGF) в сыворотке крови лабораторных животных определяли с помощью наборов для иммуноферментного анализа ELISA (Endogen, США) по прилагаемым к наборам описаниям процедуры. Концентрацию цитокинов рассчитывали в пг/мл по калибровочным кривым.

Для изучения возможных механизмов фармакологической активности дисульфидов глутатиона применялась модель in vitro с использованием специализированной клеточной культуры А431. Приготовление клеточных лизатов, электрофоретическое разделение, электроперенос, иммуноокрашивание белков и удаление с мембраны связавшихся антител проводили по методике, описанной в работе [13].

Оценку интерфероногенных свойств Na^SSG-инозина проводили методом титрования IFN-а в сыворотке крови животных опытной группы, получавших однократно внутрибрюшинно препарат в дозе 30 мг/кг. В контрольной группе мышей применяли внутрибрюшинное введение плацебо (0,85% раствор хлорида натрия).

Оценку влияния ^гОББС-инозина на систему неспецифической резистентности организма проводили путем определения в сыворотке крови по методу О.В. Бухарина (1974) концентрации лизоцима [103, 104] и с помощью метода R.C. Page et al. (1978) активности миелопероксидазы [103, 104]. Кроме того, также оценивали поглотительную и переваривающую активность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови [81].