Генетические факторы, определяющие эффективность химиотерапии

Функциональная активность белков может быть существенно изменена в результате генетического полиморфизма, который подразумевает наличие небольших изменений в первичной структуре ДНК.

Понятием полиморфизм описывают существование нескольких изоформ ферментов, различающихся по каталитическим свойствам, сродством к субстрату и степенью экспрессии. На молекулярном уровне полиморфизм выражается в изменении нуклеотидной последовательности гена. Чаще всего встречаются замены одного нуклеотида, так называемые SNP (single nucleotide polymorphism), возможны и изменение количества тандемных повторов VNTR (variable number of tandem repeats), инсерции, делеции нуклеотидов. Не все полиморфизмы оказывают одинаковое воздействие на функциональную активность фермента, значение имеют только те их них, которые находятся в кодирующией или регуляторной областях. На сегодняшний день описано 300000 SNP и число их постоянно растет [60,61,62].

Ферменты системы биотрансформации отличаются индивидуальной вариабельностью, которая проявляется при наличии генетических полиморфизмов - изменений нуклеотидной последовательности ДНК соответствующих генов, обусловливающих снижение или увеличение активности кодируемых ферментов.

Благодаря анализу полиморфизмов появилась реальная возможность тестирования пациентов на предмет переносимости или индивидуального ответа на тот или иной лекарственный препарат.

Несмотря на недостаточную эффективность, 5-ФУ и его производные продолжают оставаться одними из основных химиопрепаратов для адъювантной химиотерапии рака желудка [44, 152].

В биотрансформации 5 - фторурацила (5-ФУ) участвует ряд ферментов: тимидилатсинтетаза (ТС), дигидропиримидиндегидрогеназа (ДПД), тимидилатфосфорилаза (ТФ). Фермент карбоксилэстераза (КЭС) участвует в превращении капецитабина (кселоды) в 5 - ФУ в печени. Показано влияние снижения экспрессии перечисленных ферментов на токсичность терапии капецитабином (кселоды) и 5 - ФУ [74].

Первый представитель веществ фтопиримидинов (класса 5 -ФУ) был синтезирован в 1957 г. Charles Hiedelberger на основе экспериментов, показавших способность опухолевых клеток использовать урацил для синтеза ДНК. Активные метаболиты фторпиримидинов оказывают свою противоопухолевую активность в основном через подавление TC [128,131]. Дальнейшие исследования показали, что 5 -ФУ преобразуется в активный дезоксинуклеотид - ФдУМФ (фтордезоксиуридинмонофосфат), мощный ингибитор синтеза ДНК. Обладающий активностью продукт, ФдУМФ,

образует прочный трехкомпонентный комплекс со своим целевым ферментом, тимидилатсинтазой (ТС), и кофактором фермента, 5-10- метилентетрагидрофолиевой кислотой, таким образом блокируя переход дУМФ в дТМФ, являющийся необходимым предшественником для дТТФ (рисунок 1). дТТФ, в свою очередь, один из четырех дезоксинуклеотидных субстратов, требующихся для синтеза ДНК. Затем, при проведении как лабораторных, так и клинических испытаний, было показано, что добавление источника экзогенной фолиевой кислоты, например лейковорина (5 -формил-тетрагидрофолата), способствовало образованию ТС-ФдУМФ- фолатного комплекса. На основе фактов, полученных при изучении резистентности к лечению 5-ФУ, можно сделать вывод о том, что в подобных случаях в качестве механизма противоопухолевого действия преобладает ингибирование ТС. Резистентность к фторпиримидинам вырабатывается путем ряда изменений в биохимических процессах опухолевых клеток. Возможно, первичный механизм резистентности представлен увеличением экспрессии ТС или амплификацией ее гена, что наблюдается как в лабораторных исследованиях, так и при анализе изменений в опухолевой ткани у пациентов, принимавших 5 -ФУ.

Рисунок 1. Метаболическая трансформация 5 - фторурацила.

1. Оротат форсорибозилтрансфераза (ОФРТ); 2. Уридин фосфорилаза (УФ); 3. Тимидин фосфорилаза (ТФ); 4. Уридин киназа (УК); 5. Тимидин киназа 1 (ТК1); 6. Тимидин синтетаза (ТС); 7. Дигидрофолат редуктаза; 8. Дигидропиримидин дегидрогеназа (ДПД); 9.

Рибонуклеотид редуктаза; 10. 5' нуклеотиды и фосфатазы. Ингибирование ТС 5 -фтор - дезоксиуридинмонофосфатом обозначена пунктирной стрелкой.

Ген TYMS кодирует фермент тимидилатсинтетазу и находится на хромосоме 18 в 18р11.3. Тимидилатсинтетаза (ТС) - фермент, участвующий в синтезе de novo нуклеотидов тимина и урацила (дТМФ, дУМФ), необходимых для синтеза ДНК, и, в связи с чем, является мишенью для лекарств, в частности 5 - ФУ [9,70]. Полиморфизмы гена TYMS, которые находятся в кодирующей и регуляторной областях, участвуют в регулировании экспрессии и оказывают влияние на функциональную активность фермента TC.

Существуют следующие изменения нуклеотидной последовательности гена TYMS. В 5 'нетранслируемой области (UTR) ген TYMS содержит

тандемный повтор нуклеотидов, состоящий из 28 пар оснований (28bp - base pair) - полиморфизм 5'UTR VNTR (variable number of tandem repeats), который заключается в изменении количества повторов, один аллель содержит 2 повтора (2R), другой - 3 повтора (3R). Поскольку повторы находятся в регуляторной области, то их функция заключается в регулировании функции TC. Также может быть замена одного нуклеотида G (гуанин) на C (цитозин) во втором тандемном повторе 28 - bp в 3R аллеле - полиморфизм 5'UTR SNP (single nucleotide polymorpfism). В серии исследований было показано, что аллель, содержащий 2 повтора , а также С аллель, характеризуются более низкой экспрессией белка и, соответственно, более низкой ферментативной активностью ТС, чем аллель, содержащий 3 повтора (3R) и G аллель [77,151].

Особое значение уровень активности TC приобретает в быстро делящихся клетках, поскольку именно в них и осуществляется основная функция этого фермента. Более высокая экспрессия фермента способна в большей степени обеспечить делящиеся клетки необходимым нуклеотидом тимином и предотвратить встраивание в ДНК урацила, которое может повлечь за собой образование двухцепочечных разрывов ДНК при последующей репарации [86,99].

В нескольких исследованиях показано, что полиморфизм повторов нуклеотидов в 5 'нетранслируемой области (UTR) приводит к снижению уровня экспрессии TC, что коррелирует с ответом у больных колоректальным раком на терапию 5-фторурацилом и, тем самым, улучшая переносимость и эффективность препарата [9,113]. В других работах говориться о взаимосвязи полиморфизмов ТС с результатами лечения при пероральном приеме фторпиримодинов у больных раком желудка [91,114].

Чувствительность к препаратам платины может зависеть от активности ферментов системы детоксикации, в том числе семейства глутатион S- трансфераз (GST). Глутатион-Б-трансферазы - мультигенное семейство изоферментов, которое участвует в детоксикации большого числа электрофильных ксенобиотиков путем их конъюгации с глутатионом, а также в метаболизме некоторых эндогенных соединений (гормонов, липидов, простагландинов, лейкотриенов). Подобная детоксикация играет ключевую роль в обеспечении резистентности клеток к перекисному окислению липидов, алкилированию белков и другим процессам с участием свободных радикалов. Существует несколько классов глутатионтрансфераз в зависимости от субстрата и органной принадлежности фермента. А наличие у индивидуума того или иного полиморфного варианта может определять как значительные индивидуальные различия в метаболизме экзогенных соединений, так и рассматриваться в качестве факторов предрасположенности к некоторым заболеваниям [115,120].

Ген GSTM1 - имеет три аллельных варианта, два из которых кодируют белок с различной ферментативной активностью, а третий (GSTM1 - нуль аллель) представляет собой делецию в 10 bp (пар нуклеотидов), что приводит к отсутствию белка - продукта.

Ген GSTP1 - полиморфный вариант данного гена, приводящий к замене изолейцитина на валин в 104 кодоне значительно чаще обнаруживается у больных раком мочевого пузыря, пищевода. Также ген GSTP1 непосредственно участвует в детоксикации соединений платины. Было обнаружено, что одна нуклеотидная замена аденина (A) на цитозин (G) в

позиции 313 приводит к замене изолейцина на валин в 105 кодоне (Ile^l05Val). Данный полиморфизм существенно влияет на активность фермента, а также на чувствительность опухолевых клеток к препаратам платины [80,58]. Полиморфизм Ile/Val изучали в различных опухолях, таких как рак предстательной железы, колоректальный рак, рак молочной железы, рак пищевода и рак желудка. Исследования у больных колоректальным раком продемонстрировали улучшение показателей общей выживаемости для носителей Val аллеля после лечения такими препаратами, как 5-ФУ и цисплатин [124,142]. Также показано, что наличие хотя бы одного аллеля Val у пациентов страдающих раком желудка, является лучшим прогностическим признаком по сравнению с пациентами гомозиготными по Ile /Ile [132]. Помимо этого, есть исследования, которые показывают взаимосвязь полиморфизма GSTP1 с токсичностью химиопрепаратов [118]. Нейротоксический эффект оксалиплатина чаще развивался у больных гомозиготных по Ile, чем у пациентов, гомозиготных или гетерозиготных по 7Val [107].

Ген GSTT1 - полиморфным вариантом данного гена является аллель с протяженной делецией. У людей гомозиготных по аллелю 0/0 и характеризующихся отсутствием фермента, отмечена повышенная предрасположенность к раку желудка, эпителиальному раку яичников и базально-клеточному раку кожи [124] .

В качестве прогностических молекулярно-генетических факторов, оказывающих влияние на репарацию, апоптоз и эффективность химиотерапии, могут выступать полиморфизмы гена ТР 53.

Ген ТР 53 - онкосупрессор, который находится в хромосоме 17р в локусе 13.1, состоит 11 экзонов и известен как «сторож генома», контролирующий процессы роста и деления клеток. Является одним из ключевых генов, обеспечивающих стабильность генома, кодирующий опухолесупрессорный белок р53, вовлеченный в регуляцию клеточного ответа на стрессорные воздействия путем остановки клеточного цикла в контрольных точках для осуществления репарации ДНК либо индукции апоптоза в случае невозможности устранения ее повреждений. В процессе репарации р53 участвует не только как транскрипционный фактор, но и как структурный белковый компонент репарационного комплекса [87]. При повреждении ДНК опухолевой клетки химиопрепаратом происходит активация гена ТР53, что, в свою очередь, запускает гибель клетки через апоптоз.

Основным эффектом препаратов группы платины является прямое повреждение ДНК опухолевых клеток и образование цисплатин-ДНК- аддуктов, что приводит к активации белка р53 и остановке клеточного цикла для репарации ДНК. В том случае, если репарация повреждения ДНК своевременно не возможна, клетки гибнут путем апоптоза, при этом происходит уменьшение размеров опухоли. Чувствительность клеток опухоли к химиотерапии, таким образом, может существенно зависеть от активности генов, регулирующих процессы репарации и апоптоза.

В опухолях различных локализаций чаще всего выявляют мутации данного гена. Его противоопухолевая активность заключается в том, что снижение риска малигнизации клетки происходит за счет задержки роста клетки или запуска апоптоза при повреждении ДНК клетки. Существует несколько вариантов полиморфизмов гена ТР53 [20].

Наиболее хорошо изученным полиморфизмом является экзонный SNP полиморфизм: замена нуклеотида гуанин (G) на цитозин (C) в 72 кодоне 4 экзоне (rs1042522), которая приводит к замене аминокислоты аргинин (Arg) на пролин (Pro), являющиеся изомерами по отношению друг к другу. Соответственно, различают гомозиготные генотипы Arg/Arg и Pro/Pro, гетерозиготные генотипы Arg/Pro. Данные полиморфизмы обладают различной электрофоретической активностью, а также биохимическими и биологическими свойствами. Проведенные ранее исследования показывают, что изоформа Arg сильнее активирует апоптоз, в отличие от изоформы Pro [73, 126]. В предыдущих исследованиях было показано, что больные с полиморфизмом Pro/Pro имеют худшую выживаемость, по сравнению с другими генотипами [141,147,156]. Показано, что носители Arg аллеля ассоциированы с лучшей выживаемостью, по сравнению с носителями Pro аллеля при раке молочной железы, рака желудка на фоне проводимой адьювантной химиотерапии [148, 161]. Схожие результаты были получены по раку желудка, в которых изучалась эффективность адьювантной химиотерапии 5-ФУ и цисплатина и больных с мутацией в 72 кодоне [88]. По сообщениям российских авторов, носители гетерозиготного генотипа Arg/Pro лучше противостоят негативному воздействию внешней среды, т.к. защитная роль может быть обусловлена наличием одновременно Arg аллеля, опосредующего более выраженный апоптоз в ответ на воздействие стрессорных факторов, и Pro аллеля, способствующего более эффективной репарации ДНК при ее повреждении [6].

Другой полиморфизм заключается в удвоении (инсерция) участка из 16 пар оснований - 5'-gacctggagggctggg 3' (16 bp - base pair) в 3 интроне (rs17878362). Относительно данного полиморфизма в литературе имеются разноречивые данные. Одни авторы показали ассоциацию между инсерцией 16 bp (ТР 53 A+16) и риском возникновения рака яичника и рака легкого [136, 161], другие не отметили корреляции между наличием аллеля ТР53 А+16 в генотипе с риском развития рака молочной железы, яичников и мочевого пузыря [106]. При этом ранее не изучали взаимосвязь между эффективностью химиотерапии и данным полиморфизмом. Еще один интронный тип полиморфизма - замена гуанина (G) на аденин (A) в 61 паре нуклеотидов в 6 интроне менее изучен в плане ассоциаций со злокачественными новообразованиями. Полиморфизмы в интронных последовательностях приводят к снижению эффективности экспрессии гена и, как следствие, к снижению апоптотического индекса и эффективности репарации ДНК [161].

Также, одним из клинически важных полиморфизмов является изменение в гене тиопурин метилтрансферазы (TMPT). Фермент TPMT отвечает за метаболизм таких противоопухолевых препаратов, как 6 - меркаптопурин, 6 - тиогуанин. Генетический полиморфизм в гене TPMT приводит к трудностям в подборе адекватной дозы 6 - меркаптопурина у детей с острым лейкозом.

Низкая активность фермента приводит к тяжелой интоксикации пациентов препаратом, в то время как более высокая активность фермента сопровождалась необходимостью введения большей дозы препарата [140,145].

Представленные в мировой литературе сведения по вопросу полиморфизмов различных генов носят противоречивый характер, что может быть связано как с особенностями распределения генотипов изучаемых генов в разных популяциях, так и с недостаточной изученностью функционального проявления исследуемых полиморфизмов, в частности, в условиях использования химиопрепаратов с различными механизмами действия [20,34]. Это делает актуальными дальнейшие исследования в данном направлении с целью выявления молекулярных факторов, ассоциированных с

чувствительностью опухоли к химиотерапии.

Таким образом, исходя из того, что генетические полиморфизмы определяют индивидуальные различия в фармакодинамике и фармакокинетике химиопрепаратов препаратов, анализ ДНК - полиморфизмов может оказаться перспективным инструментом для разработки индивидуальных планов лечения, задачей которых будет являться создание панели маркеров для подбора химиотерапии с максимальной эффективностью и минимальным количеством побочных эффектов [126,143].