Использование 13С- и 15Р

Использование изотопно меченных сахаров и других меченых углеводов в качестве источник углерода — традиционный прием для культивирования различных микроорганизмов-продуце тов иных, не менее интересных для исследований ¹³С-БАВ.

Не следует забывать об использования ¹³С-меченных сахаров для изучения углеводного обме; у любых организмов — от человека до бактерий. Так, при исследованиях метаболизма глюко: и фруктозы в тканях в большинстве работ используют фруктозу, униформно меченную (т. е. по вс му углеродному скелету) атомами ¹³С. Такую [и-¹³С]-фруктозу использовали и для определен; действия лекарственных препаратов на инсулин-регулируемые ферменты углеводного обмена ч ловека. Применение в диете крыс неразрушаемого олигомера p-D-фруктозы привело к существе ному снижению концентрации триацетилглицерина и фосфолипидов в крови и клетках печек а также к снижению синтеза жирных кислот de novo.

Возросшие возможности анализа структур больших самособираюшихся биополимеров щ демонстрированы на примере основного компонента бляшек при болезни Альцгеймера — фг риллярного р-амилоида; метод DRAWS (dipolar recoupling with a windowless sequence) позволь измерять ¹³C — ¹³C расстояния между всеми атомами углерода в пределах 5А. Вообще можно не < мневаться, что развитие инженерного обеспечения изотопных исследований позволит ши использовать БАВ, несущие атомы стабильных изотопов.

^,3С- и ^1В1У-аминокислоть1 давно широко используют во врачебной практике и в биохимическ исследованиях разнообразного характера. В целом, к настоящему времени сформулировалось г ное представление об отсутствии побочных эффектов и противопоказаний к применению амиг

143

кислот, меченных стабильными изотопами, непосредственно на людях, у которых следует оценить особенность, например, липопротеинового метаболизма.

¹³С- или ¹⁵М-аминокислоты могут также являться основой в химических синтезах разнообраз­ных меченых соединений. Так, стабильно меченные L-тирозин и L-фенилаланин использовались в синтезах пептидных гормонов и нейротрансмиттеров. Меченые аминокислоты важны для нейро­химии и в диагностических целях, например, как инструмент выявления наследственной фенил- кетонурии и других заболеваний, связанных с нарушениями метаболизма аминокислот в организ­ме человека. Специфическое мечение метионина потребовалось при исследовании связывания кальция и кальций-связывающего регуляторного белка калмодулина. Стабильно меченые соеди­нения используются также для изучения метаболизма человека в экстремальных условиях, напри­мер, в условиях невесомости при полетах в космос. ¹⁵Ы-глицин использовали для измерения обще­го синтеза белка, а ¹⁵1\1-фенилаланин — для контроля за процессом синтеза белка в мышцах ног.

Исследование жирового обмена в организме человека — одно из медико-биологических направ­лений науки, активно использующее традиционные и разрабатывающее новые изотопные методы. Использование [¹⁵ЬГ]-глицина, [1-¹³С]- и [5,5,5,-В₃]-лейцина, а также [4,4,4,-О₃]-валина и дважды меченного [6,6-П₂,1,2-¹³С₂]-лизина было одним из первых шагов в изучении кинетических параме­тров аполипопротеинового метаболизма. Недавно предложен новый метод контроля за обращени­ем [1-¹³С]-пальмитиновой кислоты.

Расширяется использование стабильных изотопов в экологических исследованиях. Недавно опубликована интересная пионерская работа по изучению влияния окружающей среды на реснит­чатую инфузорию Tetrahymena pyriformis. Сравнивали две популяции инфузорий, живущих в обычной среде или в среде, загрязненной толуолом. В обоих случаях среды содержали Ь-[гуани- дино-¹⁵Г4₂]-аргинин в качестве изотопного маркера. После инкубации клеток провели полный ана­лиз распределения азота и азотсодержащих БАВ. В «толуидированных» клетках было больше включения аргинина, более высокий уровень дезаминированных соединений, в белках — повы­шенное содержание ¹⁵N в аланине, тирозине, аспарагиновой и глютаминовой кислотах, а также об­наружились ранее отсутствовавшие К[ш]-ацетиларгинин и пирролидонкарбоксиловая кислота. В целом, авторы считают, что предложенный ими метод пригоден и для эколого-медицинских ис­следований.

Меченный по ¹⁵N гидроксиламин использовали для демонстрации его прямого окисления в N,0 с последующим восстановлением до N₂ в длительной культуре почвенной бактерии Alcaligenes faecalis. Показано также, что ¹⁵NH₂OH не может быть использован этим микроорганизмом в каче­стве единственного источника азота.

Фосфотрансфераза — основной фермент системы транспорта фруктозы Bacillus subtilis, состо­ит из двух мембрано-связанных (ПА, ПВ) и двух трансмембранных (ПС, IID) субъединиц. Для изу­чения структуры ПВ-субъединицы (18 кДа) структурный ген клонировали в клетках Е. coli. Используя ¹³С- и ¹⁵КГ-меченные белки, показали, что N-концевой участок НВ имеет топологию и ло­кализацию активного центра, сходные со структурой фосфоглицеромутазы, фермента также ката­лизирующего трансферазную реакцию с образованием интермедиата — фосфогистидина.

5.2.