Фиксация мембранного потенциала

Фиксацией мембранного потенциала {voltage clamp] называется методика, при которой не клетка, а экспериментатор устанавливает значение мембранного потенциала. Поддержание постоянного напряжения ср_м при исследовании токов через возбуждённую мембрану позволяло:

1) избавиться от емкостных токов

2) ИСКЛЮЧИТЬ изменение ИОННЫХ проводимостей g_Na+ И g_K+ при изменении ср_м и изучить их изменение в различные фазы развития возбуждения: g_t= f(fj.

Постоянная разность потенциалов между внутренней и наружной поверхностями мембраны поддерживается при помощи специальной электронной схемы (рисунок 117), ключевым элементом которой является операционный усилитель.

Рисунок 117 - Схема исследования токов через мембрану с фиксацией мембранного потенциала (voltage clamg))'. 1 - микроэлектрод: 2 - электрод сравнения: 3 - серебряный проводник: 4 - генератор постоянного напряжения: 5 - амперметр

Операционный усилитель (ОУ) представляет собой усилитель по­стоянного тока, охваченный глубокой отрицательной обратной связью по напряжению. На входы в операционный усилитель подаётся мембранный потенциал ср_м = ср_вн - ср_нар, то есть разность потенциалов микроэлектро­да, помещённого внутрь аксона кальмара (1), и электрода сравнения (2).

На выходе операционного усилителя создаётся напряжение, ком­пенсирующее изменение трансмембранного потенциала. Это напряжение подаётся на серебряный проводник (3), расположенный вдоль аксона, чтобы по всему волокну была одна и та же мембранная разность потенциалов. Электронная схема удерживает на выходе (внутри аксона) тот же потенциал, что и на входе операционного усилителя, таким образом удерживается постоянный мембранный потенциал: ср_м = const.

При помощи генератора постоянного напряжения (4) можно "ступенькой" изменить входное напряжение на операционном усилителе, например, поднять его выше порогового. Электронная схема будет удер­живать это заданное напряжение во время опыта. Амперметр (5) измеряет протекающий при этом через мембрану ток (между электродом сравнения (2) и выходящим электродом операционного усилителя (3)). В опытах с фиксацией напряжения можно исследовать изменение мембранного тока во времени при развитии возбуждения, задавая разные постоянные значения мембранного потенциала ср_м.

Принято считать ток, направленный из клетки наружу в окружаю­щий раствор положительным, а из окружающего раствора внутрь клетки - отрицательным.

В экспериментах было обнаружено, что, если поднять мембранный потенциал ср_м выше порогового, то сначала течет ток внутрь клетки (фаза 1), а затем из клетки наружу (фаза 2) (рисунок 118).

Рисунок 118 - Результаты исследований мембранного тока методом фиксации напряжения

В экспериментах, проведенных Ходжкиным, Хаксли, Бейкером, Шоу, было доказано, что фаза 1 мембранного тока связана с потоком ионов натрия из окружающей среды (где концентрация натрия больше) в клетку (где она меньше), а фаза 2 объясняется вытеканием ионов калия из клетки наружу.

В своих опытах Ходжкин и Хаксли изменяли ионный состав окружающего раствора. Было обнаружено, что, если снаружи убирали натрий, то пропадала первая фаза мембранного тока (ток внутрь клетки). Следовательно, первая фаза развития потенциала действия связана с увеличением проницаемости мембраны для ионов натрия. Поток положительных частиц в клетку и приводит к деполяризации мембраны - внутренняя её поверхность заряжается положительно по отношению к наружной.

Во второй фазе резко увеличивается проницаемость мембраны для калия, и из клетки наружу выходят положительно заряженные ионы калия, в то время как натриевый ток уменьшается.

Ионный механизм развития потенциала действия был окончательно доказан в эксперименте Ходжкина, Бейкера и Шоу, в котором аксоплазму препарированного аксона заменили на наружный раствор, а ионный состав наружного раствора сделали таким же, как у нормальной аксоплазмы.

При такой замене ионных составов разность потенциалов на мембране изменила знак. Теперь в покое внутренняя поверхность мембраны была заряжена положительно по отношению к наружной. А потенциал действия оказался отрицательным.

Ходжкин и Хаксли предположили, что селективное (избирательное) изменение ионной проницаемости возбуждённой мембраны: сначала для Na⁺, а потом для К⁺ - объясняется тем, что в мембране имеются специальные ионные каналы (предположительно, это поры, образованные белковыми молекулами).

Они предположили также, что существуют отдельно натриевые и калиевые каналы, которые открываются и закрываются во время прохождения через данный участок мембраны нервного импульса.

В первой фазе - открываются натриевые каналы, во второй фазе - калиевые. А закрываются, соответственно, сначала натриевые каналы, а затем калиевые. Открывание и закрывание ионных каналов вызывается изменением мембранного потенциала.

Одним из доказательств наличия в мембране ионных каналов было обнаружение веществ-ингибиторов, блокирующих ионные потоки через мембрану.

Так, содержащийся в рыбе фугу тетродотоксин блокирует поступление внутрь клетки натрия и, таким образом, нарушает передачу нервного импульса, что может привести к летальному исходу. Доказано, что тетродотоксин не влияет на проницаемость клетки для калия, значит, ионы натрия и калия на самом деле проходят через разные каналы. Из-за своего специфического строения молекулы тетродотоксина закупоривают только натриевые каналы.

Подсчитав число застрявших в мембране молекул тетродотоксина, удалось определить количество натриевых каналов. В разных нервных волокнах позвоночных оно было разным - от 3 до 75 каналов на один квадратный микрометр площади мембраны (для сравнения, количество молекул фосфолипидов порядка 2-Ю⁶ мкм^-2).

Был обнаружен и специфический ингибитор калиевых каналов - тетраэтиламмоний. Если обработать мембрану тетродотоксином, блокирующим натриевые каналы, в опытах с фиксацией мембранного потенциала пропадает первая фаза (рисунок 118), а тетраэтиламмоний, прекращающий перенос через мембрану калия, вызывает исчезновение второй фазы.

Экспериментально ионный ток удаётся разделить на отдельные компоненты путем замены Na⁺ в среде на непроникающие катионы холина. В этом случае кинетическая кривая включает только К⁺-ком- понент.

На рисунке 119 показаны наблюдаемые кривые /(/). Если аксон погружен в морскую воду, полный ток I = /_Na + /_к изображается кри­вой 1. При замене Na⁺ холином наблюдается чистый калиевый ток - кривая 2. Разность этих двух кривых - кривая 3 - даёт натриевый ток /_Na.

Рисунок 119 - Мембранный ток и его компоненты

При быстром смещении потенциала внутри волокна на +56 мВ ("короткое замыкание" мембраны) натриевая проводимость g_Na сначала быстро растет от нуля до 25-10 ³ Ом '-см ³. а затем убывает (рисунок 120).

Рисунок 120 - Изменение натриевой и калиевой проводимости при деполяризации мембраны на 56 мВ: сплошными линиями показана проводимость при длительной деполяризации, штриховыми - при реполяризации мембраны через 0.6 и 6.3 мс

Калиевая проводимость медленно возрастает и через 5 мс достигает постоянного уровня. При реполяризации мембраны натриевая проводи­мость убывает значительно быстрее, чем калиевая.

Таким образом, было установлено, что формирование потенциала действия вызывается ионными потоками через мембрану: сначала ионов натрия внутрь клетки, а затем - ионов калия из клетки в наружный раствор, что связано с изменением проводимости мембраны для ионов калия и натрия.

12.5.