Основные свойства и характеристики морфогенетического белка кости

Хорошо известно, что процесс формирования костной ткани зависит от активности клеток, участвующих в остеогенезе, и от влияния ростовых факторов, так называемых остеоиндуктивных белков.

На сегодняшний день идентифицировано более 20 типов BMP человека. Выяснено, что среди них наибольшим остеогенным потенциалом обладают белки BMP-2, BMP-7, ВМР-6 и BMP-9.

В последние годы разработаны технологии получения рекомбинантных ВМР- 2 и ВМР-7, что позволяет использовать данные ростовые факторы в клинической

практике для расширения зоны и скорости костной репарации при проведении трансплантации.

Введение биологически активных компонентов с помощью добавления их растворимых форм или пропитки ими материалов обеспечивает лишь кратковременный эффект.

Однако процессы иммобилизации этих белков, основанные, как правило, на химической пришивке, многостадийны, трудоемки, дорогостоящи и небезопасны с точки зрения обеспечения экологической безопасности производства. Важной проблемой остается разработка методов очистки конечных продуктов от липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов; получение функционально активных биологических компонентов.

Современные биомедицинские технологии предусматривают использование данных остеиндукторов в виде рекомбинантных белков (rhBMP), фиксированных на носителях, которые могут быть синтетические, биологические, минеральные или биокомпозитные полимеры.(Булатов А.А., 2005; SciadiniM., 1995)

Несмотря на все преимущества аутологичной кости в качестве костного трансплантата (наличие клеточных элементов костного мозга, факторов роста и локального кровоснабжения), по единодушному мнению ведущих зарубежных хирургов, рекомбинантные костные морфогенетические белки (rhBMP), фиксированные на биологическом носителе, являются реальной альтернативой аутологичному костному материалу.(Brower, R.S., 2008; Burkus J.K., 2005)

Основная функция BMP- поддержание процесса костеобразования во взрослом организме. По современным научным представлениям, BMP- это

многофункциональные ростовые факторы, принадлежащие к суперсемейству B- трансформирующего фактора роста (Reddi A.H., 2000; Paralkar V.M., 1998; WozneyJ.M., 2002). BMP действуют на рецепторы клеточной мембраны и играют значительную роль в регулировании роста, дифференцирования и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, нервные и эпителиальные клетки.

Рекомбинантный человеческий костный морфогенетический белок-2 (rhBMP-2) представляет собой остеоиндуктивный фактор, который играет основную роль в процессе роста и регенерации костной ткани. Полученный в рекомбинантной форме, он продемонстрировал в эксперименте чѐткую остеоиндуктивную активность, достаточную для обеспечения сращения при ортотопической имплантации. J.W. Wang с соавторами, по-видимому, были первыми, кто показал возможности rhBMP-2 индуцировать костеобразование, когда в качестве носителя использовался неактивный деминерализованный крысиный костный матрикс.(Wang, J.W., 2006; CelilA.B., 2005; EinhornT.A., 2003)

К настоящему времени идентифицировано 20 видов BMP. Наиболее полно изученными применительно к регенерации костной ткани и хряща являются BMP-2 и BMP-7, однако есть сообщения об активном участии в остеогенезе и хондрогенезе и других видов BMP.

BMP устойчивы к температурному воздействию до 65°С, к действию 2N соляной кислоты, 6М мочевине и 4М гуанидину, но инактивируются трипсином, легко связываются с гепарином. В связи с устойчивостью BMPк воздействию коллагеназы стала возможна биохимическая экстракция их из костного матрикса.

Место локализации BMP- неклеточный соединительнотканный матрикс, содержащий остеопрогениторные и мезенхимные клетки. BMP синтезируется остеобластами, хондроцитами и их предшественниками (Burkus J.K., 2005).

Существует два технологических способа получения BMP (Wozney J.M., 2000; Sampath T.K., 1992)- биохимическая экстракция из деминерализованного костного матрикса и синтез с применением генной инженерии (rhBMP). Около 20 лет назад основным способом получения BMP была биохимическая экстракция из

костного матрикса с помощью 4М солянокислого гуанидина с последующей очисткой путем электрофореза. Из 100 кг деминерализованной костной массы можно получить около 57 мг BMP.

В связи со сложностями процесса биохимической экстракции более целесообразно получать белки с помощью генной инженерии. Выделяют следующие технологические этапы получения rhBMP (Шарапова Н.Е., 2010):

• Генноинженерная сборка биологической конструкции;

• Введение созданной молекулы в клетки бактерии E.Coli;

• Наработка достаточного объема бактериальной массы для получения необходимого количества белка;

• Выделение белка из бактериальной массы и его биохимическая очистка.

Исследования по изучению молекулярных и клеточных механизмов костеобразования показывают, что в процессе остеогенеза в месте перелома принимают участие различные ростовые факторы (цитокины), которые влияют друг на друга, взаимодействуют с несколькими типами клеток и, возможно, BMP являются среди них наиболее важными и активными остеоиндукторами.(BostromM.P., 1999)

BMP синтезируются скелетными клетками и одновременно их активизируют (Winn S.R., 1998). После синтеза, распространяясь через градиент концентрации, BMP локально проявляют свою активность в следующих вариантах: взаимодействуют с рецепторами на мембране клеток-мишеней, формируя белковый комплекс; вступают в контакт с внеклеточными белками- антагонистами (noggin, chordin), прекращая при этом свою активность. На сигналы BMP могут отвечать: клетки-мишени – плюрипотентные мезенхимные стволовые клетки, остеобласты, миобласты, фибробласты, нервные клетки; маркеры метаболизма кости – щелочная фосфотаза, остеокальцин, остеопонин, остеонектин.(NakashimaM., 2003; RuheP.Q., 2006)

BMP вызывают ускоренную дифференцировку мезенхимных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, усиливают синтез коллагена, повышают активность щелочной фосфотазы, увеличивают синтез остеокальцина,

стимулируют синтез внеклеточного матрикса и его последующую минерализацию.(Park Y.J., 2006)

Функции BMP строго отрегулированы. Взаимодействие BMP с рецепторами на мембране клеток-мишеней может тормозиться внеклеточными белками- антагонистами (noggin, chordin), которые связывают BMP и предотвращают их последующую активность. Этот механизм, возможно, является реакцией защиты организма от чрезмерной активности BMP при остеогенезе. Опыты на трансгенных мышах со значительным содержанием белка noggin в костях скелета демонстрировали выраженную остеопению.(JeppsonC., 2003; LindeA., 1995)

Балансом между концентрацией BMP и активностью их антагонистов можно управлять с целью ускорения регенерации кости. Подавление активности noggin или chordin ускоряло остеогенез в экспериментах in vitro (KwongF.N., 2008), однако на данный момент исследования направлены на изучение поставки значительных концентраций BMP на различных типах носителей.

На данный момент существуют следующие требования к носителям BMP:

• Биоинертность;

• Бимодальная пористая структура, способствующая ангиогенезу;

• Способность сохранения биологической активности BMP, а именно остеоиндуктивности, после его фиксации на носителе;

• Способность защиты BMP от распада и денатурации;

• Возможность осуществления контроля количества выделяемого биологически активного BMP в месте его действия;

• Возможность эффективной стерилизации, не повреждающей структуру BMP;

• Возможность длительного хранения.