Реакция агглютинации

Агглютинацией называется склеивание микробов (клеток) при действии на них специфических антител в присутствии электролита. Реакцию агглютинации (РА) используют в серотипаже микроорганизмов, главным образом бактерий, и в серодиагностике инфекционных болезней.

В качестве антигена в РА применяют свежевыросшую взвесь живых или убитых формалином, спиртом, нагреванием культур (диагностикумов).

Для получения агглютинирующих сывороток иммунизируют кроликов. При этом им 5-7 раз подкожно, а затем внутривенно с интервалами 2-7 сут в возрастающих дозах вводят убитые бактерии. Заканчивают курс иммунизации животных 2-3 инъекциями живых бактерий. Через неделю определяют титр сыворотки - максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки недостаточен, иммунизацию продолжают.

Полученные таким путем агглютинирующие сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для определения их вида надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует микробу в том случае, если агглютинирует его как минимум до половины титра.

Более достоверные результаты при определении вида или серовара бактерий дают адсорбированные (монорецепторные или типоспецифические) сыворотки, которые не имеют групповых агглютининов, вследствие чего нет необходимости их сильно разводить.

Развернутая РА для серотипажа микробов. Ее ставят следующим образом: в агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл неадсорбированной сыворотки, разведенной 1:100, и, перемешав, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д.

чиная с контролей.

Рис. 3. Развернутая реакция агглютинации

Отсутствие агглютинации в контроле и наличие взвешенных хлопьев в 2-3 и более пробирках опыта свидетельствуют о положительной реакции (рис. 3). Окончательные результаты учитывают через 18-20 ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре.

Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» - сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++», «++», «+» - убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка.

Заостряя внимание на агглютинате, следует указать, что для обнаружения неорганизованных антигенов простейших и гельминтов используют латекс-агглютинацию, адсорбируя их видовые иммуногены или гаптены на латекс-частицах, которые, реагируя с антителами, склеиваются в виде мелкозернистых осадков, какие образуются, например, при агглютинации мельчайших бактерий и риккетсий.

Развернутая РА для серодиагностики инфекционных болезней. Обнаружение в сыворотке больных антител к определенным видам микроорганизмов - косвенный, но очень важный показатель, так как они образуются только под воздействием возбудителя заболевания. Техника постановки развернутой РА для серодиагностики такая же, как в серотипаже. Получив сыворотку больных, ее, как и диагностическую, разводят изотоническим раствором натрия хлорида от 1:100 до 1:1600.

В качестве антигена в этой реакции используют диагностику- мы - заведомо известные взвеси убитых бактерий, с которыми безопасно работать.

Учитывается она так же, как развернутая РА для идентификации бактерий.

В тех случаях, когда в качестве антигена предполагается использовать мельчайшие микроорганизмы, например микоплазмы и вирусы или экстракты и лизаты бактерий, другие высокодисперсные вещества, комплексы которых с агглютининами увидеть невозможно даже в агглютиноскопе, прибегают к постановке реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), сорбируя их на бараньих эритроцитах. Ставится она в лунках полистироловых планшет. По чувствительности и наглядности результатов намного превосходит развернутую РА.

РНГА для серодиагностики инфекционных болезней и инвазий. Для обнаружения антител в сыворотках больных готовят эритроцитарные антигенные диагностикумы. Для этого бараньи эритроциты в течение 15 мин обрабатывают раствором таннина в разведении 1:20 000-1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют 2 ч при температуре 37 °С. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2-3 раза отмывают 0,85%-ным раствором натрия хлорида и в объеме 0,1-0,25 мл 0,5%-ной взвеси добавляют к сыворотке, разведенной от 1:10 до 1:1280 и разлитой по 0,25-0,5 мл в лунки планшет (рис. 4).

В качестве контроля используют взвеси интактных и нагруженных специфическим антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо отрицательную и положительную реакции.

Рис.

Результаты учитывают через 2 ч после инкубации в термостате. Оценивают РНГА плюсами: «++++» - эритроциты равномерно покрывают всю лунку планшеты в виде зонтика с неровными краями; «+++», «++» - осадок эритроцитов в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из несклеившихся эритроцитов; «+» - в основном видны несклеившиеся эритроциты.

Рис. 5. РНГА для выявления высокодисперсных антигенов: Эр.Ат - эритроцитарно-антительный диагностикум; Аг - антигены

При отрицательной реакции эритроциты спонтанно агглютинируют в виде плотного диска («пуговицы») на дне лунок.

РНГА для идентификации высокодисперсных антигенов. Для определения видовой принадлежности антигенов готовят антительный диагностикум, сорбируя на эритроцитах иммуноглобулины известной иммунной сыворотки. Параллельно в лунках полистироловых пластин делают двухкратные разведения антигена в объеме 0,25-0,5 мл и к каждому из них добавляют 0,1-0,25 мл сенсибилизированных антителами эритроцитов (рис. 5). Учет и оценка антительной РНГА для идентификации антигенов производится в те же сроки и по тем же показателям, которые используются в аналогичной ей реакции для серодиагностики болезней.