3 Фазово-контрастная микроскопия

Глаз человека способен обнаружить различия в волне (цвете), амплитуде (интенсивности), но не может обнаружить различия в фазе. Лучи света при прохождении через прозрачные объекты, например бактерии, уменьшают скорость и при выходе из клетки несколько запаздывают по фазе от соседних световых волн, т.е.

При помощи фазово-контрастного устройства можно различия в фазе превратить в амплитудные и за счет этого увидеть прозрачные бактериальные клетки. В результате взаимодействия обычной волны света с отставшей по фазе, т.е. в процессе интерференции, образуется третья волна дифрагированная, которая отстает от обычной волны (прямой) примерно на 1/4 длины волны.

Амплитуда дифрагированного луча невелика, и различия в интенсивности с фоном глаза практически неразличимы. Если сдвинутые по фазе лучи дополнительно искусственно задержать еще на 1/4 длины волны, то амплитуда дифрагированной волны будет намного меньше, чем у прямых лучей (фона) и объект будет виден как темный на светлом фоне, это будет так называемый позитивный фазовый контраст. Если задержать на 1/4 длины волны прямые лучи, то объект будет выглядеть светлым на темном фоне — негативный фазовый контраст.

В ветеринарных диагностических лабораториях довольно часто применяют фазово-контрастное устройство КФ-4, где используется позитивный фазовый контраст. Основные элементы фазово-контрастного устройства: фазовые объективы (х10; х0,3; х20, х0,4, х0,65; 0,90; х1,25), револьверный конденсор с диафрагмами, вспомогательный микроскоп.

Основными элементами, обеспечивающими фазовый контраст, являются кольцевая диафрагма и фазовая пластинка. Кольцевая диафрагма представляет собой светонепроницаемую пластинку с прозрачным кольцевидным участком; расположена под конденсором. Фазовая пластинка – прозрачный диск, на который напылено кольцо из металлов; расположена в задней фокальной плоскости объектива. При установке освещения объект освещается пучком света в виде полого конуса образованного кольцеобразной диафрагмой.

Все прямые лучи проходят фазовую пластинку в зоне, соответствующей прозрачному кольцу диафрагмы, а дифрагированные лучи проходят через всю площадь фазовой пластинки. Если фазовая пластинка обеспечивает дополнительное запаздывание дифрагированных лучей, то в итоге интерференции этих волн образуется темное изображение объекта (позитивный фазовый контраст). Контраст можно увеличить, заключая микроорганизмы в 25%-ный поливинилпиролидон или 30%-ную желатину. За счет этого увеличивается показатель преломления среды, без изменения такового у бактериальных клеток; в итоге увеличивается разность фаз и, следовательно, повышается контраст.