Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Современные представления о роли эндометрия и внутриматочной перфузии у пациенток с бесплодием

Бесплодие - это состояние репродуктивной системы, которое выражается в отсутствии клинической беременности после 12 или более месяцев регулярной половой жизни без использования контрацепции.

В стандартизированной программе Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 1997 г.) по обследованию и лечению бесплодных супружеских пар выделяется 22 причины женского и 16 причин мужского бесплодия. Однако общепринятой мировой классификации бесплодия не существует. Чаще всего в клинической практике выделяют нозологические формы, соответствующие международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ-10): бесплодие, связанное с отсутствием овуляции; бесплодие трубного происхождения; бесплодие маточного происхождения; бесплодие цервикального происхождения; бесплодие, связанное с мужскими факторами; неясного генеза и другие формы женского бесплодия. Кроме того, бесплодие может быть относительным и абсолютным (возможность забеременеть естественным путем исключена за счет отсутствия маточных труб, яичников, матки) [30, 42].

Среди всех форм бесплодия особый интерес представляет бесплодие неясного генеза, когда супружеская пара не способна к зачатию, но при этом современные методы обследования не выявляют причин нарушения фертильности [13, 15, 23, 24, 30]. Частота такого бесплодия достаточно высока и колеблется от 10 до 30% среди всех случаев нарушения фертильности. Критериями диагностики бесплодия неясного генеза являются фертильная сперма мужа, овуляторная концентрация прогестерона в середине лютеиновой фазы, подтвержденная проходимость маточных труб, нормальный уровень ФСГ в сыворотке крови и отсутствие патологии со стороны органов малого таза [13, 24, 180].

Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что данные проявления могут быть либо последствиями хирургических манипуляций в полости матки, либо осложнениями и самостоятельными проявлениями местных и общих патологических процессов в организме, а также проявлениями генетической предрасположенности к развитию тех или иных патологических процессов (тромбофилии, эндокринопатии и др.) [5, 15, 48, 54, 88, 153, 154]. Все патологические процессы в эндометрии, в том числе проявляющиеся и вненозологическими формами, приводят к структурнофункциональным изменениям эндометрия, снижающим его рецептивность и

препятствующим успешному наступлению и развитию беременности [25, 38, 41, 46, 88, 158, 165, 177, 195, 202].

Имплантация - это синхронный процесс прикрепления и последующего внедрения бластоцисты, способной к адгезии и инвазии, в рецептивный эндометрий. Период, возможный для имплантации, ограничен, соответствует 6-8 дню после пика лютеинизирующего гормона (чаще всего 20-22 день менструального цикла), и носит название «окна имплантации» [30, 92, 108, 155, 197].

Имплантация включает в себя 3 стадии - аппозиции, адгезии, инвазии.

оплодотворенной яйцеклетки по маточной трубе, 3 - формирование бластоцисты в полости матки; первые три стадии занимают от 72 до 96 часов. Далее происходит разрушение блестящей оболочки бластоцисты - хэтчинг. Стадия 4 - короткий этап противостояния (аппозиция) и дальнейшая инвазия (стадия 5). Взаимодействия клеток эндометрия и бластоцисты является двусторонним: разрушенные в начале процесса инвазии частицы

эндометриального или трофобластического внеклеточного матрикса, активируют последующий процесс при помощи специфических матриксных металлопротеиназ, кроме того, интегрины, расположенные на поверхности цитотрофобласта, тоже способствует приобретению миграционных и инвазивных свойств эмбриона. Стадия 5 характеризуется окружением и дальнейшей инвазией многоядерного синцития в артерии эндометрия с последующим полным погружением синцитиотрофобласта.

Весь этап имплантации длится 11-12 дней: от овуляции до формирования ворсин хориона (из синтициотрофобласта). На стадии 5с эмбрион полностью погружен в эндометрий, его окружает слой синцитиотрофобласта [138].

Особенности сосудистых реакций в период имплантации у человека изучены мало, однако, известно, что у большинства млекопитающих в этот период наблюдается ограниченное увеличение микрососудистой

проницаемости. После внедрения бластоцисты в эндометрий в эксперименте с крысами было показано резкое сокращение количества капилляров, окружающих бластоцисту [161, 178]. По всей вероятности, этот

удивительный факт относительной изолированности от материнских энергетических источников связан с необходимостью ослабления иммунологических свойств ткани матери. При этом аваскулярная зона окружена сосудами большего диаметра в сравнении с капиллярами, расположенными вдали от места имплантации.

эндоваскулярным цитотрофобластом [28, 45, 46].

Общеизвестно, что для успешной имплантации необходим функционально активный эндометрий. В настоящее время принято считать, что причина имплантационных потерь в 30% случаев связана с эмбрионом и в 70% - с нарушениями имплантационных возможностей эндометрия [60, 92, 104].

Структурной единицей эндометрия является железа с окружающей ее стромой (соединительная ткань с фибробластами, гистиоцитами, плазматическими и другими клетками) и прилегающими сосудами [17, 51]. Процесс подготовки эндометрия цикличен, начинается в фазу пролиферации с нарастания толщины эндометрия, при которой происходит большое количество митозов, железы трансформируются из прямых в извитые с широким просветом, определяются отек и разрыхление стромы [42, 51]. Далее в фазу секреции преобразованные железы начинают секретировать ряд биологически активных веществ, участвующих в процессе имплантации [17, 29].

Формирование зрелого эндометрия обеспечивается адекватной стимуляцией эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в железах и клетках стромы. Яичниковые стероиды являются основными регуляторами морфологических изменений функционального слоя эндометрия, но большую роль играет число активных рецепторов и их соотношение в ткани эндометрия нежели абсолютное значение гормонов в крови. Экспрессия стероидных рецепторов во время окна имплантации находится под влиянием гормонов и может изменять свою активность в соответствии с уровнем их выработки [1, 25, 128, 139]. Рост и формирование рецептивного эндометрия тесно связаны с перфузионными возможностями, уровень внутриматочной перфузии отражает возможность эндометрия к развитию и функциональной активности [88, 117]. Кровеносные сосуды эндометрия формируют

уникальную динамически изменяющуюся за короткое время (менструальный цикл) систему, в отличие от других тканей, где структура и функции постоянны в течение всей жизни.

Как известно, матка кровоснабжается за счет маточных и яичниковых артерий. Правая и левая маточные артерии являются основными сосудами, несущими кровь от внутренних подвздошных артерий к матке. Возле перешейка у боковой поверхности матки маточная артерия разделяется на нисходящую и восходящую ветви. Восходящая ветвь маточной артерии, проникая в миометрий, образует аркуатные артерии, располагающиеся на границе наружной и средней трети мышечного слоя. Аркуатные артерии часто анастомозируют между собой, формируют «аркуатный венок» матки и располагаются по периметру тела матки вблизи серозной оболочки. Толща миометрия кровоснабжается радиальными артериями, которые затем переходят в базальные и спиральные артерии [11, 17, 36, 42].

Огромную роль в развитии эндометрия и последующей имплантации играет процесс ангиогенеза - образования новых кровеносных сосудов [98, 182, 183]. В течение менструального цикла выделяют три последовательные стадии ангиогенеза [6]:

1. регенерацию сосудистого «ложа» во время десквамации эндометрия, в результате которой новые коллатеральные сосуды образуются от артериол и венул в точке ниже раневой поверхности эндометрия [146];

2.

3. скручивание спиральных артерий, рост артериол, ангиогенез в секреторную фазу цикла.

Ангиогенез в течение менструального цикла играет важнейшую роль в процессах роста, формирования, созревания эндометрия и, таким образом, является одним из ключевых моментов, определяющих успех имплантации и развития эмбриона [119, 151, 182, 183].

Морфологическим превращениям, происходящим в эндометрии в процессе ангиогенеза, посвящено много исследований, однако наиболее дискутабельным остается вопрос о факторах, оказывающих влияние на процесс ангиогенеза. К группе ангиогенных факторов относят сосудистый эндотелиальный фактор роста, ангиопоэтины, факторы роста фибробластов (FGF, TGF-a), IL-1,IL-6, эпидермальные факторы роста -IL-8 ,EG, ангиотензина II и другие [6, 13,36, 45, 183,188, 192].

В частности, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) - основной регулятор ангиогенеза в эндометрии [48, 113, 157, 183, 188, 192], увеличивающий пролиферативную активность клеток эндотелия и проницаемость сосудов, способствующий усилению ангиогенных свойств эндометрия [152], участвующий в координации процессов дифференцировки, миграции и инвазии трофобласта [44]. N. Sugino и соавт. в своей работе подчеркивали важность VEGF и его рецепторов в процессах имплантации и развития беременности, так как своей максимальной секреции VEGF клетками железистого эпителия и стромы эндометрия достигает в середине фазы секреции, а под воздействием эстрогенов и прогестерона выделение VEGF усиливается [188]. Безусловное влияние VEGF и стероидных гормонов на процесс васкуляризации эндометрия описано во множестве работ [188, 192, 196]. С другой стороны, в работах последнего времени внимание исследователей привлекают гены, предрасполагающие к нарушению процесса ангиогенеза, выработки VEGF и других ангиогенных факторов. Так, например, в работе. R. Boudjenah и соавт. в 2012 году была продемонстрирована связь между носительством аллеля С гена VEGF +405 G/C и повышенным риском имплантационных потерь в циклах ЭКО, по-видимому, за счет снижения экспрессии VEGF в ткани эндометрия [80]. Изучению генетических предикторов риска развития того или иного заболевания - генов предрасположенности - в последнее десятилетие посвящено много внимания в мировой научной литературе. Существует ряд заболеваний, при которых изменения в генетическом материале не являются обязательными к их развитию, однако при определенных внешних условиях (гиподинамия, табакокурение и др.) и сочетаниях с другими заболевания возможно развитие болезней, которые носят называние мультифакториальных [44, 118, 169]. В комплексе с неблагоприятными внешними факторами гены предрасположенности обуславливают развитие целого ряда состояний, в частности, бесплодия, злокачественных новообразований, эндокринопатий, тромбофилий и др.

При изучении связи нарушения имплантации и полиморфизма гена VEGF (G(-1154)A) было отмечено, что у носителей полиморфной аллели - 1154A происходит снижение плазменной концентрации VEGF и замедление процессов ангиогенеза, что может негативно влиять на имплантацию [120].

Отдельного внимания заслуживает потенциальное влияние на процесс имплантации наследственных и приобретенных тромбофилий, а также состояний, предрасполагающих к их развитию. В настоящее время не подвергается сомнению значение тромбофилий в невынашивании беременности [28, 46, 47, 82, 83], однако продолжает обсуждаться их роль в нарушении функциональных свойств эндометрия, в процессе имплантации и, таким образом, формировании бесплодия. У пациенток с повторными имплантационными неудачами ряд исследователей обнаружил более высокую частоту антифосфолипидных антител и генов, предрасполагающих к развитию тромбофилии (мутации Лейдена и протромбина, полиморфизмы генов MTHFR, MTRR, ингибитора активатора плазминогена 1типа - PAI-1), но, тем не менее, связи между ними и вероятностью наступления беременности в циклах ВРТ не выявили [148, 189]. По данным C.Coulam, частота генетических полиморфизмов генов была в 1,6 раза выше у бесплодных женщин с неудачными попытками ЭКО в анамнезе, по сравнению со здоровыми [90]. Аналогичные данные представили H. Qublan и соавторы: у женщин с неудачными попытками ЭКО в 68,9% случаев определялся один из наследственных или приобретенных факторов тромбофилии, при этом у здоровых женщин они встречались лишь в 25% случаев [198].

В последнее время появляется все больше работ, рассматривающих бесплодие неясного генеза и/или неудачные попытки ЭКО в анамнезе как основание для назначения обследования на наследственные и приобретенные тромбофилии [8, 35, 79]. С другой стороны, существует ряд исследований, не подтверждающих генетические различия между бесплодными и

фертильными женщинами [82, 86, 149,190].

Возможные механизмы нарушения имплантации при тромбофилии остаются малоизученными. Очевидно, что чрезмерная активация

свертывания крови, эндотелиопатии и локальные микротромбозы, сопровождающие тромбофилии, оказывают влияние на этапе инвазии бластоцисты, когда так важны процессы неоангиогенеза [6, 15, 28, 36]. Есть исследования, подтверждающие, что повышение в крови уровня РА1-1(при носительстве полиморфизмов гена PAI-1, АФС) сопровождается снижением глубины инвазии трофобласта. Механизм повреждения эндометрия при мутациях генов фолатного обмена (MTHFR, MTRR) связан с повышением уровня гомоцистеина в крови, который вызывает уменьшение диаметра сосудов, повышение агрегации тромбоцитов и эндотелиопатию [8, 35, 43, 91].

Механизмы нарушения имплантации при АФС изучены лучше: происходит нарушение сигнальных взаимодействий бластоцисты и эндометрия за счет снижения синтеза молекул медиаторов NK-клетками, уровень которых при АФС в крови и эндометрии повышается. Кроме того, связывание антифосфолипидных антител с клетками приводит к развитию нестабильности их мембран и гиперкоагулации за счет ингибирования активности протеина С или эндотелиальной простациклин-синтетазы. Таким образом, генетические и иммунные тромбофилии, особенно при их сочетании, нарушают динамическую систему гемостаза, находящуюся в состоянии равновесия между слабой активацией коагуляционного каскада и и антикоагулянтной и фибринолитической системами, что предотвращает развитие спонтанных тромбозов и обеспечивает полноценный процесс инвазии эмбриона и его дальнейшего развития в стенке матки [27, 28, 46, 47].

Соответственно, аллельные полиморфизмы генов ангиогенеза и развития тромбофилии могут принимать участие в нарушении процесса имплантации и являться скрытой причиной бесплодия неясного генеза [35, 115]. Развитие эндометрия и процесс последующей имплантации невозможен без функционально активных рецепторов к стероидным гормонам в ткани эндометрия [20, 49, 60, 99, 101]. Экспрессия рецепторов не является постоянной, а претерпевает циклические колебания.

Изучая возможные причины нарушения имплантации, многие исследователи выявили аутоиммунные нарушения на системном уровне и в эндометрии. Так, даже в середине секреторной фазы у женщин с бесплодием неясного генеза экспрессия выработанных маркеров (LIF, IL-1, VEGF, CAS) имплантации нарушена [13]. LIF (лейкемия-ингибирующий фактор) - один из известных на сегодняшний день модуляторов имплантации, влияющий непосредственно на трофобластную дифференцировку и опосредует формирование «диалога» между эндометрием и бластоцистой. IL-1 (интерлейкин-1) - ключевой регулятор воспалительного ответа, являющийся паракринным фактором, который также опосредует связь между эндометрием и эмбрионом в период имплантации [64, 81, 87, 98, 108].

Кроме того, причиной нарушения имплантации может стать нарушение процесса апоптоза, необходимого для преодоления эмбрионом эпителия эндометрия. Адекватный уровень апоптоза необходим также для осуществления стадий адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта в процессе физиологической имплантации [13, 194].

Вопрос оценки рецептивности эндометрия является дискутабельным и обусловлен отсутствием признанных маркеров его полноценности, однако его объективная оценка является важнейшим фактором для выявления возможных причин бесплодия или имплантационных потерь при проведении циклов ВРТ [15, 25, 34, 60, 104].

Aflatoonian A. и соавт. (2011 г.) выделили 4 основных метода оценки маточной рецептивности:

1. гистологическое исследование эндометрия;

2. определение уровня прогестерона и эстрадиола в крови;

3. МРТ;

4. ультразвуковое исследование эндометрия с помощью аппарата экспертного класса [63].

Что касается гистологической оценки эндометрия, то «золотым стандартом» оценки функции и ультраструктуры эндометрия долгое время считалось раздельное диагностическое выскабливание матки с последующим морфологическим исследованием. В репродуктологии данный метод применяется прежде всего для определения дефекта лютеиновой фазы при задержке в развитии секреторной трансформации эндометрия более чем на два дня, что является достаточно трудным для диагностики [42, 171]. Кроме того, методика является дорогостоящей, инвазивной, сопряжена с рядом осложнений, а так же невозможна к применению в динамическом порядке, поэтому применение ее у всех пациенток при отсутствии грубой патологии в полости матки является неоправданным [21].

Pipelle-биопсия является альтернативным, менее инвазивным, дешевым методом морфологической оценки эндометрия, в том числе его рецепторного аппарата [14, 15, 91].

В последнее время разрабатываются новые методы и критерии оценки рецептивности эндометрия - допплерометрия, определение биологически активных веществ и стероидных гормонов в сыворотке крови, генетический профиль и т.п [109, 165, 170, 182, 186, 197].

Рядом исследователей предложено использовать в оценке качества эндометрия показатели уровней эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови. Так, еще в 1972 году R. Israel отметил, что секреторная трансформация эндометрия сочетается с уровнем прогестерона более чем 3 нг/мл (10 нмоль/л) [124].

Известно, что эстрадиол способствует гипертрофии и гиперплазии клеток миометрия и эндометрия, и, соответственно, росту эндометрия. A. Kurjak, D. Jurcovic в 1990 г. опубликовали данные о соответствии между толщиной эндометрия и концентрацией эстрадиола и прогестерона в крови [137]. Подобные результаты своих исследований представили J. Remohi и соавт., наблюдавшее достоверно более тонкий эндометрий у пациенток с концентрацией эстрадиола менее 100 пг/мл, чем у тех, у кого этот показатель превышал 400 pg/ml, однако корреляции между уровнем эстрадиола и наступлением беременности выявлено не было, что говорит о недостаточной роли этого метода в оценке функциональных свойств эндометрия [164].

В то же время, T. Li, Ben Nun в группе с соавторами выявлили, что показатели уровня эстрадиола и соотношения эстрадиола к прогестерону по сравнению с данными гистологического исследования неточно характеризовали стадию развития эндометрия. Свои данные эти исследователи связывают со значительными суточными и индивидуальными колебаниями этих гормонов в крови; кроме того, концентрация эстрадиола может характеризовать активность гранулезных клеток, но не отображать зрелость эндометрия [77, 142, 130].

В последнее десятилетие исследователями были предложены маркеры рецептивности эндометрия, выявленные при подробном изучении клеточных и молекулярных механизмов имплантации - факторы роста [55], пиноподии [64, 78, 101, 125], молекулы клеточной адгезии - интегрины, селектины, категрины и иммуноглобулины (альфа-1, бета-1; альфа-4, бета-1; альфа-5, бета-3) [67, 128, 129]. В частности, большой научный интерес представляет изучение пиноподий - структур, появляющихся в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия и существующих в течение 24-48 часов между 19 и 21 днем цикла [61, 193]. Термин «пиноподии» в данном случае является не совсем корректным, так как они не являются исходом пиноцитоза, в отличие от животных пиноподий [62], однако данное название было получено в связи с первыми выявленными у грызунов образованиями, производными абсорбцией маточного секрета [78, 172]. Функции пиноподий до конца не исследованы, некоторые авторы предполагают наличие на их поверхности экспрессии молекул, необходимых для аппозиции и адгезии бластоцисты: НОХА 10, глютаредоксин [64, 78, 102], гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста - HB-EGF; другие авторы отрицают значение пиноподий в оценке имплантационных возможностей эндометрия на прегравидарном этапе, так как пиноподии определяются и в секреторной фазе цикла, и при беременности до 11 недель [199].

Методом иммуногистохимического исследования эндометрия у пациенток, страдающих бесплодием, выявлялись снижение содержания маркеров ангиогенеза (VEGF), рецептивности (LIF) и воспаления (IL-1), и повышение уровня маркера апоптоза CAS, в связи с чем ряд авторов предложил использовать данные маркеры как критерии полноценности эндометрия в период «имплантационного окна» [13, 34].

Развитие эндометрия и процесс последующей имплантации невозможен без функционально активных рецепторов к стероидным гормонам в ткани эндометрия [20, 94, 99]. Экспрессия рецепторов является непостоянной и претерпевает циклические колебания. Определение количества прогестероновых (РП) и эстрогеновых рецепторов (РЭa), а также их соотношения в эндометрии иммуногистохимическим методом предложено рядом авторов для оценки функциональной активности эндометрия. При варианте соотношения РП/РЭa