Клиническое значение ММP и ТIМP при опухолях яичников Желатиназы.

ММP-2 (желатиназа А) и ММP-9 (желатиназа В) -

протеазы, гидролизующие коллаген IV типа – основной компонент базальной мембраны эпителиальных опухолей, но они также разрушают другие существенные компоненты ВКМ и обладают желатинолитической активностью.

причем индукция ММP является одним из ключевых механизмов проинвазивных эффектов EGF [115] и b-TGF [260]. Показано, что эти протеазы находятся в комплексном взаимодействии с VEGF: с одной стороны, коллагеназы индуцируют секрецию VEGF опухолевыми клетками, что способствует образованию асцита [72, 200, 314], а с другой стороны, секретируемый опухолью VEGF регулирует экспрессию коллагеназ в строме, влияя на инвазивную способность опухоли [72, 301]. Так, по данным А.Zhang et al. [314] экспрессия ММР-2 активируется VEGF-A. Наряду с активным протеолизом базальной мембраны происходит активная экспрессия опухолевыми клетками Ang-2, который совместно с VEGF вызывают локальную деструкцию сосуда, что способствует активизации процесса васкулярного ремоделирования ткани и миграции пролиферирующих ЭК при участии секретируемых опухолью ММР [266, 314]. Инвазия эндотелия в соединительнотканный матрикс сопровождается усиленной экспрессией ими трансмембранных белков - интегринов (a_vb₃, a_vb₅), которые играют важную роль в васкулогенезе, а также таких факторов адгезии как ICAM и VCAM [124, 152]. ICAM опосредуют прикрепление ЭК к ВКМ. Факторы адгезии обеспечивают накопление мононуклеаров в васкулярной зоне. Последние активируют пролиферацию и миграцию ЭК [120].

Показано, что активность ММP-2 и ММP-9 в культивируемых клетках РЯ увеличивается и под действием гормонов стресса (катехоламинов), при этом в 2-3 раза возрастает инвазивность опухолевых клеток в тестах in vitro [194].

Следует отметить, что система ММP/ТIМP, и в первую очередь, коллагеназы, играет ключевую роль в процессах ремоделирования ВКМ, связанных с развитием нормального фолликула в яичниках [144]. ММP-2 и ММP-9, а также ТIМP-1, 2 и 3 локализуются в оболочке развивающихся фолликулов и в строме яичников, именно вокруг фолликулов выявляется наибольшая желатинолитическая активность коллагеназ. Качественные характеристики созревающего фолликула во многом зависят от уровня и соотношения компонентов ММP/ТIМP системы. Желатинолитическая активность проявляется и во время образования желтого тела, а также играет ключевую роль в его регрессии. В лютеинизированных гранулезных клетках женщин с синдромом поликистозных яичников баланс между ММP и TIMP сдвинут в сторону увеличения активности ММP. В связи с этим предполагают роль активации ММP-2 и ММP-9 в нарушении атрезии фолликулов при этом заболевании [193].

В наиболее ранних клинико-лабораторных исследованиях, посвященных

роли коллагеназ при раке и других новообразованиях яичников, изучали экспрессию и активность ММP в РЯ различной степени злокачественности в

сопоставлении с клинико-морфологическими характеристиками. Так, M.S.Naylor et al. [220] оценивали экспрессию нескольких ММP, в том числе ММP-9, в биоптатах РЯ методами зимографии и FISH. В большинстве образцов были обнаружены соответствующие мРНК, локализовавшиеся преимущественно в стромальных участках, причем максимальную экспрессию наблюдали в областях смежных с областями скопления опухолевых клеток. Зимографически выявлено, что активность ММP-9 в биопсийных образцах РЯ была значительно выше, чем в опухолях других локализаций, изученных этими авторами ранее, однако, в отличие от других опухолей, никакой корреляции между активностью ММP-9 и степенью дифференцировки РЯ не обнаружено.

K.Sakata et al. [263] исследовали методом ИГХ экспрессию ММP-9 и ММP-2, а также МТ1-ММP, ТIМP-1 и ТIМP-2 в РЯ. Частота выявления всех исследованных белков, за исключением ТIМP-1 в РЯ была значительно выше, чем в ПОЯ и ДНЯ.

В то же время K.Q.Cai et al. [86], исследуя методами ИГХ, зимографии,

Northern и Western blot анализа биоптаты и различные культуры клеток РЯ, обнаружили, что ММP-9 и ММP-2 чаще выявляются в пренеопластических тканях и клетках, чем в карциномах с уже установившимся злокачественным фенотипом. Авторы не выявили взаимосвязи уровня экспрессии обеих ММP со стадией заболевания и степенью злокачественности РЯ. Более того, ММP-2, достаточно часто выявлявшаяся в пренеопластических поражениях яичников, как правило, экспрессировалась на низком уровне или вообще отсутствовала в раковых клетках. На основании этих данных авторы предположили, что увеличение экспрессии коллагеназ происходит на ранних стадиях злокачественной трансформации эпителия яичников и является одним из этиологических факторов этого процесса и/или фактором риска возникновения

РЯ. Косвенно это предположение подтвердили T.Paulsen et al. [240], исследуя ИГХ серозные ПОЯ у 99 больных и показавшие, что интенсивное окрашивание первичной опухоли на ММP-2 достоверно чаще выявляется при наличии неинвазивных имплантатов, чем при их отсутствии (76 и 53%, соответственно).

M.Maatta et al. [196] сравнивали экспрессию ММP-9 и ММP-2, а также TIMP-1, TIMP-2 в 22 ДНЯ, 15 ПОЯ и 16 РЯ. ММP-2 обнаружена в 56% ДНЯ, в

40% ПОЯ и в 90% РЯ, экспрессия остальных маркеров также была выше в ткани РЯ, чем в ДНЯ и ПОЯ. На основании этих данных авторы пришли к заключению, что с точки зрения экспрессии коллагеназ и ТIМP ПОЯ находятся ближе к ДНЯ, чем к РЯ. Усиление экспрессии ММP-9 и ММP-2 при переходе от ДНЯ к РЯ продемонстрировали также B.Schmalfeldt et al. [268].

M.Furuya et al. [134] исследовали содержание и активность ММP и ТIМP в содержимом и выстилающем эпителии кист при муцинозных опухолях яичников. Активность ММP-9 выявлена во всех РЯ и ПОЯ и в 7 из 15 аденом, при этом измеренное ИФА содержание ММР-9 в кистозной жидкости было достоверно выше при карциномах, чем при ПОЯ и ДНЯ. Активность ММP-2 при различных муцинозных поражениях яичников не зависела от их злокачественности и была практически одинаковой, а содержание этой протеазы при РЯ хотя и было повышено по сравнению с ДНЯ и ПОЯ, но различия не достигали уровня статистической значимости. Авторы отметили также достоверное увеличение уровней ТIМP-1 и ТIМP-2 в муцинозных РЯ по сравнению с ПОЯ и ДНЯ. В другой работе они описывают результаты исследования 24 серозных опухолей яичников. Обнаружено достоверное повышение содержания ММP-9 и ММP-2 в кистозном содержимом аденокарцином по сравнению с серозными аденомами, при этом уровни ТIМP-1 и ТIМP-2 в РЯ и ДНЯ не различались [134].

L.W.Huang et al. [162] методами ИГХ и FISH исследовали 90 РЯ различной злокачественности и продемонстрировали достоверное увеличение экспрессии ММP-9 в серозных и муцинозных карциномах по сравнению с ДНЯ и ПОЯ. В противоположность другим авторам, они также показали, что уровень ТIМP-1, образующего комплексы с активной формой ММP-9, был повышен как в РЯ, так и в ПОЯ по сравнению с ДНЯ.

Наибольший интерес представляют работы, в которых оценено значение различных ММР для прогноза РЯ. Так, в одном из наиболее ранних исследований B.Davidson et al. [103], определяя экспрессию ММP-2 и ММP-9 в первичных опухолях и метастазах 45 больных распространенным (III-IV стадии

FIGO) РЯ методом in situ гибридизации мРНК, показали, что высокий уровень экспрессии мРНК обеих коллагеназ в опухолевых клетках является фактором неблагоприятного прогноза безрецидивной и общей выживаемости. B.Davidson et al. [104] подтвердили эти данные в дальнейшем, оценив ретроспективно 20- летнюю выживаемость больных, однако исследования других авторов показали, что зависимость эта не столь однозначна.

Одной из наиболее значимых следует признать публикацию S.Sillanpaa et al. [279], проанализировавших 292 РЯ. В этом исследовании показано, что ММP-9 присутствует почти во всех исследованных тканях, однако клиническое значение экспрессии этой протеазы в эпителиальных опухолевых клетках и в строме противоположно. Так, с увеличением распространенности процесса уменьшается процент опухолевых клеток с высокой экспрессией ММP-9 и увеличивается доля таких клеток в строме. В соответствии с этим при однофакторном анализе общей группы больных было продемонстрировано увеличение 10-летней выживаемости у больных с высоким уровнем экспрессии ММP-9 в опухоли и ее уменьшение при высоком уровне экспрессии этой протеазы в строме. При многофакторном анализе сохранилось только прогностическое значение уровня экспрессии ММP-9 в опухолевых клетках при I стадии РЯ по FIGO. Авторы предположили, что ММP-9 играет двойную роль в прогрессии РЯ, препятствуя распространению опухоли, если она находится на эпителиальных клетках, и способствуя ему, находясь на клетках стромы.

В аналогичном исследовании, включавшем 90 больных РЯ, высокая

экспрессия ММP-9 выявлена в опухолевых клетках в 97% случаев, а в клетках стромы – в 70% [170]. Высокая экспрессия ММP-2 обнаружена этими исследователями в опухолевых клетках в 54% случаев, а в строме – в 38%.

S.Ozalp et al. [234] ретроспективно исследовали опухоли 45 больных (30 – РЯ и 15 – ПОЯ), оценивая интенсивность ИГХ окрашивания на ММP-9 по трехбалльной шкале. Интенсивность окрашивания эпителиальных клеток в злокачественных опухолях была более высокой, чем в ПОЯ, а уровень экспрессии ММP-9 в строме РЯ и ПОЯ достоверно не различался. Уровень экспрессии ММP-9 в эпителиальных клетках злокачественных опухолей не

зависел от стадии заболевания и не оказывал влияния на выживаемость больных. В то же время, как и в вышеописанных исследованиях, высокий уровень экспрессии ММP-9 в строме РЯ оказался фактором неблагоприятного прогноза. A.Demeter et al. [105], оценивавшие зимографически активность ММP-2 и ММP-9 в экстрактах опухолей, асцитической жидкости и сыворотке крови 27 больных эпителиальными опухолями яичников, показали, что только активность ММP-9 была достоверно повышена в опухолях и асците тех пациенток, у которых за время 30-месячного наблюдения возник рецидив, по сравнению с нерецидивировавшими.

В большом ретроспективном исследовании S.Sillanpaa et al. [279] иммуногистохимически оценена экспрессия ММP-2 в 295 первичных опухолях и 67 метастазах РЯ и показано, что низкая экспрессия этой протеазы в опухолевых клетках ассоциирована с 3 степенью злокачественности и эндометриоидным типом опухоли. При многофакторном анализе высокий уровень экспрессии ММP-2 в опухолевых клетках оказался фактором благоприятного прогноза 10-летней безрецидивной выживаемости больных РЯ. В то же время, M.Perigny et al. [241], исследуя ретроспективно опухоли и перитонеальные имплантаты 100 оперированных в 1990-2000 гг. больных РЯ III стадии, показали, что гиперэкспрессия ММP-2 в опухолевых клетках перитонеальных имплантатов ассоциирована с ухудшением общей выживаемости больных по данным многофакторного анализа, при этом экспрессия этой коллагеназы в клетках первичных опухолей не влияла на прогноз. А ранее X.Wu et al. [310], используя комплекс методов (полуколичественный RT-PCR анализ, ИГХ, иммуноблоттинг), показали, что уровень экспрессии ММP-2 в РЯ выше, чем в эпителиальных ДНЯ, не зависит от основных клинико-морфологических характеристик, но является фактором неблагоприятного прогноза.

Еще в одном исследовании P.L.Torng et al. [292] изучали экспрессию ММP-2, активатора ММP-2, МТ1-ММP и ТIМP-2 в 35 эндометриоидных и 49 серозных РЯ, сопоставляя результаты со стадией, степенью злокачественности и размером опухоли, а также безрецидивной и общей выживаемостью больных. Однофакторный анализ показал, что высокая стромальная экспрессия ММP-2 достоверно связана с распространенной стадией, высокой злокачественностью и серозным гистотипом опухоли, меньшим размером первичной опухоли во время операции, а также с большей частотой рецидивов заболевания. Однако уровень экспрессии ММP-2 не влиял на уровень смертности больных. При многофакторном анализе стромальная экспрессия ММP-2 влияла только на выживаемость больных эндометриоидным РЯ.

Матрилизин (ММP-7). В эту подгруппу помимо ММP-7 входит еще ММP-26, называемая также эндометазой или малой протеазой эндометрия. Помимо разрушения компонентов ВКМ, ММP-7 участвует в процессинге некоторых молекул клеточной поверхности – Fas-лиганда, про-TNF-a, E- кадгерина. Секреция ММP-7 эпителием РЯ стимулируется VEGF и IL-8. В опытах in vitro показано, что ММP-7 увеличивает инвазивность клеток РЯ, активируя про-ММP-2 и про-ММP-9 [300].

Впервые усиление экспрессии ММP-7 в опухолях яичников было продемонстрировано H.Tanimoto et al. [286], исследовавшими методом RT-PCR

32 РЯ, 12 ПОЯ и 10 нормальных яичников. Уровень мРНК этой протеазы оказался повышенным примерно в 75% РЯ и ПОЯ. В дальнейшем эта же группа авторов, исследовав 44 муцинозных РЯ, ИГХ подтвердили увеличение экспрессии матрилизина в клетках РЯ, независимо от степени их злокачественности [276]. ММP-7 обнаружена в слизистом секрете этих опухолей. В то же время показано, что активность ММP-7 чаще выявлялась в РЯ (87%), чем в ДНЯ (28%) [134]. Интересно, что в отличие от описанных выше желатиназ ММP-7 не обнаружена в строме РЯ [133].

Наиболее репрезентативное исследование клинического значения ММP-7 при РЯ было представлено в работе S.M.Sillanpaa et al. [280]. ИГХ исследованы

284 первичных РЯ, 36 метастазов и 8 нормальных яичников. В опухолях эндометриоидного строения большая площадь и высокая интенсивность окрашивания на ММP-7 были достоверно ассоциированы с положительным окрашиванием ядер клеток на b-катенин. Во всей группе в целом и в подгруппе неэндометриоидных раков низкий процент окрашивания на ММP-7 коррелировал с высокой степенью злокачественности опухоли, распространенной стадией и большим объемом остаточной первичной опухоли после операции. Оцененная ретроспективно 10-летняя безрецидивная и общая выживаемости больных оказались значительно лучше при высоком проценте интенсивного окрашивания на ММP-7, чем при низком, причем при многофакторном анализе этот показатель оказался независимым фактором благоприятного прогноза.

A.Acar et al. [55] методом твердофазного ИФА определяли содержание ММP-7 в сыворотке крови 28 больных РЯ, 2 – с ПОЯ, 10 женщин с доброкачественными гинекологическими заболеваниями и 30 здоровых женщин. Уровень ММP-7 у больных РЯ был достоверно повышен по сравнению с контролем и снижался после удаления опухоли. У женщин с ДНЯ уровень ММP-7 был промежуточным между контролем и больными РЯ, но достоверно не отличался ни от одной из этих подгрупп. По данным S.F.Zohny et

al. [317], содержание ММP-7 в сыворотке крови является достаточно чувствительным (80,0%) и специфичным (87,5%) маркером дифференциальной диагностики РЯ, лишь незначительно уступая СА-125. Более того, сочетанное использование СА-125, ММP-7 и двух других маркеров (хемокиновых лигандов CCL11 и CCL18) позволяет выявить ранний РЯ с чувствительностью 94,4%. По данным Е.С.Герштейн и соавт. [12], полученным при обследовании 84 первичных больных различными новообразованиями яичников ММP-7 является значимым серологическим маркером РЯ. Чувствительность теста относительно контроля при 95%-ной специфичности составляет 78%. Уровень ММР-7 также положительно коррелировал с ключевыми показателями распространенности РЯ: стадией, размером опухоли, наличием и характером диссеминации по брюшине и метастазов в большом сальнике, наличием и количеством асцита. Предлагалось также включить ММР-7 в комплексный тест дифференциальной диагностики РЯ (Meinhold-Heerlein I. et al., 2007).

Матриксная металлопротеиназа мембранного типа 1 (МТ1-ММP, ММP-14). МТ1-ММP или ММP-14 - трансмембранная коллагеназ, активная МТ1-ММP служит рецептором клеточной мембраны для формирования латентного комплекса ММP-2 (про-ММP-2) и тканевого ингибитора ТIМP-2. Она протеолитически активирует на клеточной поверхности про-ММP-2, разрушающую коллаген IV типа, а также сама гидролизует коллагены I, II и III типов и некоторые другие белки ВКМ. МТ1-ММP задействована на многих этапах метастазирования РЯ [282], в частности, участвует в формировании и диссеминации по брюшине мультиклеточных агрегатов, слущивающихся с поверхности опухоли в брюшную полость [215]. Вместе с другими ММP она способствует формированию так называемого «коллагенолитического» инвазивного фенотипа РЯ.

ИГХ выраженная экспрессия МТ1-ММP в опухолевых клетках РЯ

выявлена A.A.Kamat et al. [170] в 100% случаев, в стромальных клетках – только в 38%. Высокая экспрессия этой протеазы в строме была ассоциирована с клинико-морфологическими признаками агрессивности процесса: поздней стадией, высокой степенью злокачественности опухоли, наличием метастазов в лимфатических узлах и асцита. Уменьшение безрецидивной выживаемости больных РЯ было связано с высокой экспрессией МТ1-ММP как в строме, так и в эпителии, а наиболее значимым фактором неблагоприятного прогноза оказалась высокая эпителиальная экспрессия МТ1-ММP.

Ретроспективный анализ 20-летней выживаемости больных РЯ III-IV стадий в зависимости от уровня экспрессии мРНК МТ1-ММP, определенного методом гибридизации in situ, также подтвердил неблагоприятное влияние повышенной экспрессии этой ММP на прогноз [104]. Кроме того, эти авторы

подтвердили наблюдение A.A.Kamat et al. [170] о том, что в отличие от других ММP, МТ1-ММP выявляется преимущественно в клетках эпителия и почти отсутствует в строме [104]. Неблагоприятная роль МТ1-ММP, в особенности при ее ко-экспрессии с ММP-2 и ТIМP-2, в прогнозе выживаемости больных РЯ продемонстрирована также K.Sakata et al. [262]. В одной из недавних работ продемонстрирована важная роль МТ1-ММP (ММP-14) в пролиферации и метастазировании редкой формы РЯ – светлоклеточной аденокарциномы [56].

ТIMP. В ткани РЯ ТIМP-1 и ТIМP-2 находятся как в строме, так и в опухолевых клетках. Данные о соотношении уровня экспрессии ТIМP-1 в РЯ, ПОЯ и ДНЯ немногоисленны и противоречивы. Так, M.Furuya et al. [134], S.F.Zohny et al. [317] продемонстрировали ИФА увеличение содержания этого маркера в кистозной жидкости больных серозным и муцинозным РЯ [56]. B.Davidson et al. [104] выявили увеличение уровня экспрессии ТIМP-1 в ткани РЯ ИГХ и FISH. В то же время K.Sakata et al. [263] обнаружили, что диффузное ИГХ окрашивание на ТIМP-1 было интенсивнее в ДНЯ и ПОЯ, чем в аденокарциномах яичников. Более того, по данным этих авторов, высокая экспрессия ТIМP-1, в особенности, в сочетании с низкой экспрессией ММP-9, способствует метастазированию РЯ в лимфатические узлы.

Наиболее интересные результаты получены при исследовании ТIМP-1 в сыворотке крови. Так, M.Maatta et al. [196] предложили использовать сывороточный ТIМP-1 для дифференциальной диагностики опухолей яичников с высоким и низким злокачественным потенциалом. По их данным уровень ТIМP-1 в сыворотке крови больных достоверно возрастал при переходе от ДНЯ (137-616, медиана – 250 нг/мл) к ПОЯ (63-587, медиана – 357 нг/мл) и далее к РЯ (199-983, медиана 443 нг/мл). M.Rauvala et al. (2005) также показали, что высокая концентрация ТIМP-1 в сыворотке крови больных опухолями яичников во время постановки диагноза коррелировала со злокачественным фенотипом опухоли, а у больных РЯ – с агрессивным фенотипом и неблагоприятным прогнозом: повышенный уровень ТIМP-1 обнаружен при распространенных стадиях, размерах остаточной опухоли более 2 см, плохом ответе на цитотоксическую терапию, более короткой безрецидивной и общей выживаемостью. Авторы считают, что повышенный дооперационный уровень ТIМP-1 в сыворотке крови является фактором неблагоприятного прогноза РЯ. В то же время в другом своем исследовании они не выявили взаимосвязи динамики изменения уровня ТIМP-1 в процессе химиотерапии с ее эффективностью [252]. Ранее неблагоприятное прогностическое значение высоких показателей ТIМP-1 в плазме крови больных РЯ продемонстрировали L.Manenti et al. [200].

В исследовании, проведенном параллельно на образцах тканей и

культурах клеток опухолей яичников T.J.Kim et al. [177] показали, что гиперэкспрессия ТIМP-2 в клетках РЯ ингибирует апоптоз, индуцированный цисплатином, и индуцирует ММP-2, и поэтому полагают, что ТIМP-2 может способствовать росту серозных опухолей яичников. В подтверждение этого предположения, D.Davidson et al. [104] продемонстрировали неблагоприятное прогностическое значение высокой экспрессии мРНК и белка ТIМP-2 в опухолевых и стромальных клетках распространенного РЯ, причем уровень экспрессии ТIМP-2 в строме оставался значимым показателем прогноза и при многофакторном анализе. В то же время, L.Manenti et al. [200], P.L.Torng et al. [292] не подтвердили роли ТIМP-2 в прогнозе РЯ. По данным K.Sakata et al. [263], экспрессия ТIМP-2 повышена в РЯ по сравнению с ДНЯ и ПОЯ. Кроме того, тройное диффузное положительное ИГХ окрашивание на ТIМP-2, ММP-2 и МТ1-ММP ассоциировано с распространенными стадиями и высокой степенью злокачественности РЯ. M.Maatta et al. [195] также выявили более высокую экспрессию ТIМP-2 в РЯ, чем в ПОЯ. Однако T.Okamoto et al. [232], сравнивавшие уровни экспрессии нескольких ММP и ТIМP в опухолях и окружающих гистологически неизмененных тканях больных РЯ различного гистологического строения, утверждают, что повышенная экспрессия ТIМP-2 наблюдалась только при светлоклеточном раке и является уникальным свойством этого достаточно редкого гистологического варианта РЯ.

В отличие от ТIМP-1, уровень ТIМP-2 в сыворотке крови больных РЯ не связан с клинико-морфологическими особенностями и прогнозом заболевания [251], но имел тенденцию к повышению у больных раком по сравнению со здоровыми женщинами. При этом у больных с полным ответом на химиотерапевтическое лечение после оптимально проведенной операции отмечены более высокие уровни ТIМP-2, чем у больных с частичным ответом [252].

В единичных исследованиях продемонстрировано также увеличение

экспрессии ТIМP-3 и ТIМP-4 по мере увеличения инвазивности РЯ [258], однако дальнейшего прикладного развития эти работы пока не получили.