ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Род Cryptococcus включает около ста видов микромицетов, из них признанными патогенами является только комплекс Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii [120].

В настоящее время криптококковая инфекция является актуальной медицинской проблемой. Ежегодно из 1 миллиона заболевших криптококкозом в мире умирает 650 тысяч больных. Летальность составляет 3-5 % в странах Европы и Америки и до 80% в странах Африки, и зависит от уровня экономического развития страны [115]. Без применения противогрибковых препаратов летальность при криптококкозе составляет 100% [133]. Наряду с этим периодически регистрируют вспышки криптококкоза у лиц без признаков иммунодефицита, которые обусловлены гипервирулентными штаммами Cryptococcus gattii [247; 81].

В последние годы отмечен рост резистентности грибов рода Cryptococcus к к флуконазолу [212, 20]. В России показатели резистентности C. neoformans к флуконазолу, как к основному антимикотическому препарату для лечения криптококкоза, достигают 15 % [250]. Есть сведения о появлении штаммов C. neoformans, устойчивых к действию вориконазола [212]. Данный факт обуславливает поиск новых альтернативных средств, обладающих антикриптококковой активностью.

Несмотря на то, что основной путь инфицирования человека криптококками ингаляционный, криптококковая пневмония встречается крайне редко и заболевание диагностируется, как правило, на стадии криптококкового менингоэнцефалита или диссеминации. Макрофаги являются первыми иммунными клетками, контактирующими с C. neoformans в легких, поэтому

фагоцитоз криптококков макрофагами сегодня рассматривают как один из главных механизмов, контролирующих возникновение инфекции и ее исход [153].

Вопрос о том, какую стратегию для выживания используют C. neoformans в зависимости от факторов патогенности после поглощения фагоцитами и какому из механизмов микробоцидности принадлежит доминирующая роль при взаимодействии макрофагов с криптококками разной вирулентности, до сих пор остается открытым. Кроме того, известно, что развитие инфекционного процесса при криптококкозе, как и при других микотических заболеваниях, сопровождаются продукцией провоспалительных и противовоспалительных цитокинов [133]. Однако данные об особенностях цитокинового профиля макрофагов после взаимодействия с C. neoformans разной вирулентности малочисленны и противоречивы.

Учитывая вышеизложенное, мы сконцентрировали свои экспериментальные исследования на изучении взаимодействия макрофагов со штаммами C. neoformans разной вирулентности.

Степень разработанности темы исследования. Область исследования патогенных штаммов C. neoformans в Российской Федерации в основном охватывает вопросы, посвященные изучению факторов патогенности C. neoformans и их роли в патогенезе криптококкоза [Елинов Н.П., Васильева Н.В., Цинзерлинг В.А., Майская М.Ю., Тилева Е.А., Босак И.А.]. Особенности взаимодействия фагоцитарных клеток с разными по вирулентности штаммами C. neoformans фрагментарно отражены только в работах зарубежных исследователей [Voelz K., Vecchiarelli A., Missall T., Zaragoza O., Brown G.D. Netea M., Casadevall A. и др.]. В большинстве случаев проведенные исследования сосредоточены на сравнении двух или нескольких изолятов криптококков, различающихся между собой по степени вирулентности. Среди изучаемых штаммов, как правило, встречаются генетически модифицированные невирулентные мутанты. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для выяснения роли вирулентности C. neoformans в иммунопатогенезе криптококкоза. Для этого мы провели экспериментальное исследование по изучению функциональной активности

макрофагов на всех этапах взаимодействия с клиническими изолятами C. neoformans разной вирулентности in vitro.

Цель исследования. Изучить особенности функциональной активности макрофагов при взаимодействии со штаммами Cryptococcus neoformans разной вирулентности in vitro.

Задачи исследования. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить вирулентность клинических изолятов C. neoformans на модели экспериментального криптококкоза у мышей.

2. Изучить особенности фагоцитоза резидентными перитонеальными макрофагами интактных мышей штаммов C. neoformans разной вирулентности.

3. Исследовать способность штаммов C. neoformans разной вирулентности индуцировать продукцию макрофагами активных форм кислорода и оксида азота.

4. Оценить продукцию цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-23, TNF-α и TGF-β1) резидентными перитонеальными макрофагами мышей при взаимодействии со штаммами C. neoformans разной вирулентности.

5. Определить влияние факторов патогенности на чувствительность штаммов C. neoformans к азоловым препаратам и антимикробным пептидам животного происхождения.

Научная новизна исследования. Впервые проведен сравнительный анализ влияния вирулентности клинических изолятов Cryptococcus neoformans на функциональную активность макрофагов in vitro.

Впервые было показано, что все исследованные штаммы C. neoformans не обладают способностью стимулировать продукцию супероксид и нитроксид анионов интактными макрофагами. Также впервые показано, что в случае предварительной стимуляции макрофагов липополисахаридом сильно вирулентные штаммы подавляют продукцию оксида азота, а слабовирулентные

оказывают противоположное действие. Фактором микробоцидности при первичном взаимодействии макрофагов, стимулированных ЛПС, как с сильновирулентными, так и со слабовирулентными штаммами C. neoformans является продукция оксида азота.

Впервые установлены особенности цитокинового профиля перитонеальных макрофагов мышей при взаимодействии с C. neoformans, характеризующийся отсутствием продукции провоспалительных цитокинов и взаимосвязью выработки IL-10 и IL-13 с вирулентностью штаммов.

Впервые исследована противогрибковая активность суммарной фракции протегринов (PG-1, PG-2, PG-3) в отношении клинических изолятов C. neoformans in vitro и выявлена взаимосвязь чувствительности штаммов C. neoformans к данным антимикробным пептидам со способностью к меланинообразованию.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представленная диссертационная работа является фундаментальным научным исследованием, результаты которого вносят вклад в изучение иммунопатогенеза криптококкоза. Работа носит экспериментально-теоретический характер. Результаты исследования создают основу для поиска путей коррекции нарушенных иммунных процессов и разработки методов прогнозирования течения заболевания у больных криптококкозом. Изучение чувствительности штаммов C. neoformans к современным и новым альтернативным противогрибковым средствам вносит вклад в повышение эффективности антифунгальной терапии больных криптококкозом.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы в научных исследованиях, связанных с изучением особенностей взаимодействия микромицетов и фагоцитов.

Внедрение результатов исследования. Результаты настоящего исследования внедрены в учебный процесс и научную работу кафедры медицинской микробиологии и кафедры клинической микологии, аллергологии и иммунологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздрава России, в учебный процесс кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО

ПСПбГМУ им. акад. И.П.Павлова Минздрава России, в учебный процесс кафедры инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических заболеваний) ФГБОУ ВМА им. С.М. Кирова Минобороны РФ.

Методология и методы исследования. Методологическая основа диссертационной работы состояла в последовательном применении методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного экспериментального исследования с использованием микробиологических, физико-химических, иммунологических и статистических методов.

Положения, выносимые на защиту:

1.

2. Выявлены различия между штаммами C. neoformans в отношении выработки оксида азота макрофагами, активированными липополисахаридом: сильновирулентные штаммы ингибируют продукцию оксида азота, а слабовирулентные штаммы оказывают стимулирующее действие.

3. Установлена взаимосвязь вирулентности штаммов C. neoformans с продукцией макрофагами цитокинов IL-10 и IL-13, определяющими формирование непротективного иммунного ответа.

4. Штаммы C. neoformans чувствительны к протегринам in vitro независимо от степени вирулентности. Меланинообразующая способность клеток C. neoformans снижает их чувствительность к действию протегринов.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов, полученных при проведении экспериментов, подтверждается достаточным и репрезентативным объёмом выборки выполненных наблюдений и контрольных исследований, и подтверждена адекватными методами статистической обработки данных. Методы математической обработки полученных результатов соответствуют поставленным задачам.

Материалы диссертации доложены на 17-ом и 18-ом конгрессах международного общества по медицинской и ветеринарной микологии ISHAM (Токио, Япония, 2009 г.; Берлин, Германия, 2012 г.), на 4-ом и 5-ом конгрессе

«Тенденции в медицинской микологии» (Афины, Греция, 2009 г.; Валенсия, Испания, 2011 г.), на 9-ой международной конференции по криптококку и криптококкозу ICCC (Амстердам, Нидерланды, 2014), на ежегодной Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии «Кашкинские чтения» (Санкт- Петербург, Россия, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014 гг.) на заседании Санкт- Петербургского отделения Общества иммунологов Российской Федерации (Санкт-Петербург, 2013).

Личное участие автора в получении результатов. Автором были спланированы и лично выполнены все экспериментальные исследования по проблеме и проведена статистическая обработка данных.

Публикации по материалам исследования. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 5 статей, из них 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации и 12 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 299 источников. Текст диссертации иллюстрирован 11 таблицами, 25 рисунками и микрофотографиями.

Диссертационная работа выполнена в НИЛ иммунологии и аллергологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Северо- Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации.