Основные инъекционные модели БА
БА - нейродегенеративное заболевание, которое приводит к нарушению деятельности отделов головного мозга, связанных с когнитивными функциями. В связи с этим может быть использован ряд стратегий для моделирования БА in vivo в зависимости от конечной цели, например: исследования природы нарушения того или иного вида памяти или механизмов, лежащих в основе гибели нейронов.
Дегенерация холинергических нейронов базальных ядер переднего мозга - один из наиболее ранних этапов БА, коррелирующий с проявлением когнитивно-
го дефицита у пациентов (Coyle et al., 1983; Winkler et al., 1998). В связи с этим модели, созданные с помощью фармакологических воздействий, воспроизводящих холинергический дефицит, наблюдаемый на ранних стадиях БА, можно отнести к традиционным (McDonald, Overmier, 1998; Yamada, Nabeshima, 2000). Этот подход использовали как в экспериментах на грызунах, так и в работах на приматах. С этой целью обычно инъецируют антагонисты мускариновых ацетилхолиновых рецепторов, такие как скополамин, или повреждают определенные структуры мозга. К последней категории относятся модели, включающие разрушение крупноклеточного базального ядра, септо-гиппокампального пути или гиппокампа, которые могут быть реализованы различными средствами, например при помощи возбуждающих аминокислот ^-метил^-аспартата, каината, хинолината, квискволата и т.п.). Как правило, эти модели позволяют получить у животных нарушения обучения и памяти, которые в большей или меньшей степени связаны с гипофункцией холинергической системы. Критический обзор этих моделей был дан в работе (McDonald, Overmeier, 1998). Такой подход позволяет получить так называемые аналогичные модели - моделировать поведенческий и холинергический дефицит у животных, однако без характерной патоморфологической картины течения БА (т.е. без образования амилоидных бляшек и нейрофибриллярных сплетений).
Следует отметить также, что при БА обнаружена и существенная утрата глутаматергических ассоциативных связей в коре, которая коррелирует с тяжестью патологии (Francis et al., 1993). Поэтому моделирование на животных с использованием только антихолинергических агентов не может рассматриваться как полноценная модель БА.В конце 1980-х - 1990-х годах были разработаны новые подходы к моделированию БА на животных, прежде всего грызунах. Среди них можно выделить использование внутримозговых инъекций специфического холинотоксина AF64A (этилхолин азиридиний) или селективного цитотоксина 192-IgG-сапорина (Walsh, 1997). AF64A - токсический аналог холина, который был исходно предложен в качестве холинергического нейроспецифичного токсина. Установлено, что в малых дозах (1-3 нмоль) AF64A вызывает продолжительную холинергическую гипофункцию (Hanin et al., 1987) и гибель холинергических нейронов в медиальном ядре перегородки (Chrobak et al., 1988; Lorens et al., 1991). AF64A имеет холиноподобную структуру, соединенную с высокореактивным цитотоксическим азиридиниевым кольцом. Благодаря такому сходству система транспорта холина может захватывать AF64A и вносить его внутрь клетки, где токсин угнетает синтез ацетилхолина. Это выражается в первую очередь в нарушении системы активного транспорта холина, снижении активности холинацетилтрансферазы (ХАТ), холинкиназы, холиндегидрогеназы, ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в холинергических теминалях (Hanin et al., 1987; Hanin, 1996). Эти процессы приводят к возникновению пресинаптической холинергической гипофункции, сопровождающейся снижением синтеза и высвобождения ацетилхолина. Указанный эффект является специфическим, поскольку AF64A не влияет существенно на активность ферментов, которые не используют холин в качестве субстрата. Не изменяются и уровни других нейротрансмиттеров, а именно: дофамина, норадреналина, серотонина и их метаболитов как в гиппокампе, так и в стриатуме, амигдале, фронтальной и париетальной коре (Chrobak et al., 1988, 1989; Walsh, 1997).
AF64A снижает активность ХАТ в гиппокампе крыс, не затрагивая при этом фронтальную и париетальную кору, стриатум, амигдалу (Chrobak et al., 1988; Lorens et al., 1991; Walsh et al., 1994). Следует отметить, что хотя AF64A является нейротоксином, воздействующим на холинергические клетки, он может также вызывать изменения норадренергической и серотонинергичес- кой трансмиссии (Eva et al., 1987).Холинергическая гипофункция сопровождается когнитивными нарушениями, проявляющимися в различных поведенческих тестах, позволяющих оценить состояние процессов памяти у крыс. Было установлено, что введение АF64А нарушает выработку и сохранение условной реакции пассивного избегания (Abe et al., 1993; Bailey et al., 1986; Brandeis et al., 1986; Mannisto et al., 1994; Miyamoto et al., 1993; Walsh et al., 1984; Yamammoto et al., 1993), равно как и обучение и воспроизведение реакции активного избегания (Mannisto et al., 1994; Miyamoto et al., 1993). АF64А ухудшает выполнение животными задач, требующих участия пространственной памяти - обучение в радиальном лабиринте (Brandeis et al., 1986; Walsh et al., 1984) и водном лабиринте (Brandeis et al., 1986; Opello et al., 1993; Wortwein et al., 1994; Yehuda et al., 1995). В то же время, Д.К. Лим с сотрудниками (Lim et al., 2001) показали, что нарушения пространственной и непространственной памяти у крыс после AF64A со временем исчезают. Расширенное тестирование с AF64A в более сложных задачах до сих пор не предпринималось. Вероятно, как и в случае повреждения крупноклеточного базального ядра, AF64A может приводить к возникновению состояний, характерных для более поздних стадий БА, при которых происходит дегенерация в базо-кортикальном холинергическом пути (McDonald, Overmier, 1998).
Еще одним токсином, который получил широкое распространение в исследованиях, направленных на понимание патологии холинергической системы при БА, является иммуноглобулин 192-IgG-сапорин. Этот иммунотоксин был создан на основе моноклонального антитела к низкоаффинному рецептору фактора роста нервов (NGF) p75NTR и гликозида мыльнянки лекарственной сапорина (Wiley et al., 1991).
Токсическое действие сапорина связано с инактивацией рибосом. Связываясь с рецепторами p75NTR, расположенными на мембране холинергических нейронов, 192-IgG-сапорин проникает внутрь клетки по механизму, сходному с нейротрофином NGF, и ретроградно транспортируется клеткой в сому, где расщепляется с высвобождением сапорина. Сапорин инактивирует рибосомы нейрона, что приводит к гибели клетки. Известно, что интрацеребровентрикулярное введение 192-IgG-сапорина вызывает существенное снижение функциональных показателей холинергической системы в проекционных зонах холинергических нейронов, новой коре и гиппокампе, значительному уменьшению иммунореактивности ХАТ и АХЭ в медиальном септальном ядре и диагональном ядре полоски Брока (Waite et al., 1994, 1995). В то же время, изменения обучения и памяти у крыс после введения этого иммунотоксина не столь однозначны. Некоторые авторы сообщают о нарушении памяти у крыс при обучении в водном лабиринте Морриса (Waite et al., 1994, 1995), а другие отмечают отсутствие выраженного эффекта 192-IgG-сапорина на пространственное обучение и память, отмечая, что изменения памяти, наблюдаемые в водном лабиринте, в большей степени связаны с нарушением поведения вообще (Baxter et al., 1995, 1996).Модели БА, использующие свойства амилоидного-Р-пептида (АР), можно разделить на две большие группы: трансгенные и нетрансгенные модели. Несмотря на большую популярность работ с использованием методов генной инженерии, позволяющих получать лабораторных животных, экспрессирующих в мозге белок-предшественник Ар, число исследований с применением относительно простого введения различных фрагментов Ар продолжает увеличиваться. Это связано с несколькими факторами. Во-первых, как уже отмечалось, число генетически обусловленных случаев семейных форм БА относительно невелико. Во-вторых, главное преимущество трансгенных моделей - образование амилоидных бляшек в мозге - проявляется только при довольно высоком уровне экспрессии гена белка- предшественника Ар человека в мозге мышей.
В-третьих, отсутствие значительных нейродегенеративных изменений у трансгенных мышей не позволяет моделировать механизмы патогенеза БА, связанные с гибелью нейронов.Введение Ар в мозг животных (крыс или мышей) приводит к развитию дисфункции, связанной с нейродегенерацией и нарушениями процессов обучения и памяти. Способность Ар и его синтетических аналогов вызывать когнитивный дефицит была продемонстрирована разными авторами. Так, введение пептидов АР(1- 40) и АР(12-28) в мозг нарушало воспроизведение реакции активного избегания в Y-образном лабиринте у мышей (Flood et al., 1991, 1994) и крыс (McDonald et al., 1994), обучение пассивному избеганию (Nabeshima et al., 1994) и обучение в Y-образном лабиринте с использованием пищевого подкрепления у крыс (McDonald et al., 1994, 1996). Инъекция АР(1-42) в базальные ядра вызывала нарушение выработки пассивного избегания и нарушение поведения в тесте «открытое поле» (Harkany et al., 1998, 1999). Хроническое введение АР(1-42) в латеральные желудочки мозга крыс также нарушало поведение в водном лабиринте (Nitta et al., 1994). Острые и хронические интрагиппокампальные инъекции АР(1-40) не нарушали выполнение стандартной задачи в 8-рукавном лабиринте (McDonald et al., 1994), хотя острая инъекция нарушает выполнение этой задачи при 30-секундной задержке между 4 и 5 выборами рукавов (Sweeney et al., 1997). Приведенные данные свидетельствуют о том, что инъекции Ар-пептидов вызывали возникновение амнезии у мышей и крыс.
В своих экспериментах T Маурик с сотрудниками (Maurice et al., 1996, 1998) индуцировали амнезию у мышей с помощью центрального введения агрегированного Ар(25-35). Введение АР(25-35) до обучения вызывало дозо-зависимое нарушение рабочей памяти в тесте спонтанного чередования рукавов в Y-образном лабиринте и нарушение обучения и воспроизведения реакции пассивного избегания. Эти нарушения поведения наблюдались при однократном введении агрегированного Ар(25-35) в дозах 3 и 9 нмоль. Введение АР(25-35) крысам вызывало нарушение пространственной рабочей памяти в радиальном 8-рукавном лабиринте (Степаничев и др., 2004а,б; Stepanichev et al., 2003a,b, 2004; Yamaguchi, Kawashima, 2001) и обучения в Y-образном лабиринте (Степанов и др., 2006).
Инъекция агрегированного АР(25-35) в боковые желудочки мозга крыс вызывала нарушение памяти в водном лабиринте (Муганцева, Подольский, 2009; Delobette et al., 1997).Введение АР(25-35) в ядра перегородки (Terranova et al., 1996) или боковые желудочки мозга крыс (Klimentiev et al., 2007; Stepanichev et al., 2003a,b; Степаничев и др., 2000) нарушало обонятельную память в тесте социального взаимодействия (social recognition) у крыс. У крыс введение АР(25-35) вызывает нарушение ориентировочно-исследовательского поведения в тесте «открытого поля» (Пшенникова и др., 2005; Степаничев и др., 1997) Ряд авторов продемонстрировали трудности выработки и сохранения реакции пассивного избегания у крыс, вызванные введением АР(25-35) (Nabeshima et al., 1994: Yamaguchi, Kawashima,2001), однако этот эффект Ар(25-35) в значительной мере зависит от дозы пептида и времени наблюдения после его введения (Stepanichev et al., 2003a,b, 2006).
Нарушения краткосрочной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса были продемонстрированы на крысах после билатеральных инъекций АР(25- 35) в гиппокампальные области СА1-СА3 (Chen et al., 1996a,b). Е.М. Сигурдссон с сотрудниками (Sigurdsson et al., 1997а) показали, что билатеральные интраамиг- далярные инъекции АР(25-35) не оказывали влияния на поведение в водном лабиринте Морриса и условную реакцию одностороннего избегания, вызывая лишь незначительные изменения поведения крыс в тесте «открытого поля». На отсутствие влияния Ар на процессы обучения и памяти указывают и некоторые другие авторы (Von Linstow Roloff et al., 2002).
Впервые способность АР(1-40) вызывать дегенерацию нейронов и их отростков в мозге in vivo была продемонстрирована Н. Коваллом с сотрудниками (Kowall et al., 1992). В других ранних работах in vivo при инъекциях Ар в гиппокамп и кору больших полушарий мозга крыс не удавалось обнаружить существенных изменений, которые были бы сходны с морфологической картиной БА (Games et al., 1992; Stein-Behrens et al., 1992). По всей видимости, отсутствие эффектов Ар могло быть связано с использованием в этих исследованиях неагрегированных пептидов, поскольку известно, что нейродегенерация, вызванная Ар in vitro, зависит от его фибриллярной b-структуры: агрегированный Ар обладает большей нейротоксичностью по сравнению с неагрегированным пептидом (Delobette et al., 1997; Pike et al., 1995). Позднее нейротоксичность фибриллярных фрагментов Ар in vivo была неоднократно подтверждена в работах разных исследовательских коллективов (Степаничев и др., 2000, 2004а; Geula et al., 1998; Giovannelli et al., 1995; Harkany et al., 1998; Maurice et al., 1996; Nitta et al., 1994; Sigurdsson et al., 1997a,b; Stepanichev et al., 2004, 2006; Weldon et al., 1998). Нейротоксические свойства целого пептида сохраняются и у ряда фрагментов, в частности характерны для фрагмента Ар (25-35). Н. Ковалл с сотрудниками (Kowall et al., 1992) установили, что инъекция АР(25-35) в кору больших полушарий мозга крыс вызывала локальный некроз в месте введения, окруженный зоной гибели нейронов и глиозом, однако дистантной нейродегенерации не наблюдалось. Интрагиппокампальные инъекции агрегированного AP(25-35) вызывали повреждения в гиппокампе крыс и действовали на уровни нейротрансмиттеров в двух подкорковых структурах, которые имеют проекции аксонов в гиппокампе: голубом пятне и медиальной перегородке (Chen et al., 1996a; Stepanichev et al., 2003b). Унилатеральное введение AP(25-35) в амигдалу крыс вызывало экспрессию белка тау-2 в телах нервных клеток ипсилатеральных амигдалы, цингулярной коры и гиппокампа и иммунореактивность к антителам Alz-50 в ипсилатеральной амигдале (Sigurdsson et al., 1996).
Следует заметить, что сроки возникновения когнитивных нарушений после различных манипуляций значительно варьируют. Так, введение фрагментов АЬ в структуры или латеральные желудочки мозга приводит к возникновению амнезии, которая проявляется начиная с 4-го дня после операции (Yamaguchi, Kawashi- ma, 2001), и, как установлено в работах М. Степаничева (Степаничев и др., 2000; Stepanichev et al., 2003а), сохраняется, по крайней мере, до 180-го дня после введения. В то же время, некоторые функциональные нарушения после введения AP(25- 35) могут иметь приходящий характер. Например, было показано (Stepanichev et al., 2014), что нарушение выработки и воспроизведения условной реакции замирания на предъявление экспериментального контекста возникало через 12 дней после введения AP(25-35). В то же время, при тестировании через 6 и 28 дней после инъекции AP(25-35) животные демонстрировали уровень фризинга, сходный с контролем. Эти результаты согласуются с полученными ранее данными (Urani et al., 2004; Wang et al., 2007; Tsunekawa et al., 2008; Jin et al., 2009; Dineley et al., 2010). Время возникновения нарушений памяти также было сходным с тем, что сообщали другие авторы. В то же время, в большинстве из цитированных работ эта форма поведения была исследована лишь однажды, и практически ни в одной из них не сообщалось о временном развитии когнитивных нарушений после введения Ap.
Ранее было показано, что нарушения контекст-зависимой памяти коррелируют с холинергической дисфункцией (Jin et al., 2009), включая снижение уровня ацетилхолина, активности и экспрессии гена ХАТ. Кроме того, ингибирование АХЭ (Tsunekawa et al., 2008) или аллостерическое потенцирование рецепторов ацетилхолина (Wang et al., 2007) снижало выраженность когнитивных нарушений, вызванных AP(25-35). В нашей работе было установлено, что появление нарушений памяти было связано со снижением числа ХАТ-позитивных нейронов в медиальном септальном ядре, которое наблюдалось через 12 дней после введения AP(25- 35) в боковые желудочки мозга (Stepanichev et al., 2014). Вместе с тем, через 28 дней после воздействия, несмотря на то что число холинергических нейронов оставалось сниженным, поведение крыс в тесте условно-рефлекторного замирания не было нарушено.
3.