Метод дифференцировки токсического действия различных металлов на клетки почек, печени и сердца, неполовозрелых животных.
Экопатогенные факторы, особенно в сочетании с другими причинными агентами, увеличивают риск развития хронических болезней особенно в детском возрасте. Основной внутриклеточной мишенью действия тяжелых металлов, как и многих других химических вредных веществ является митохондрия, что подтверждается изменением их формы, структуры и размеров.
В основе токсического действия металлов на функцию митохондрий лежит ингибирование электрохимического градиента вследствие повреждения как дыхательной цепи митохондрий, так и цикла Кребса и гликолиза, поставляющих НАД, что ведет к изменению мембранного потенциала. Показано, что кадмий способен ингибировать цитратсинтетазу, сукцинатдегидрогеназу в цикле Кребса и цитохром-С-оксидазу дыхательной цепи митохондрий, снижать способность митохондрий окислять НАД на 35%. Нарушение дыхательной функции митохондрии неминуемо ведет к активации свободно радикальных механизмов под воздействием тяжелых металлов, усиление перекисного окисления липидов, нарушение кальциевого гомеостаза и окислительного метаболизма клетки.В связи с этим в настоящей работе была поставлена задача с использованием нового уникального метода определения токсического действия тяжелых металлов выявить чувствительность к ним различных органов в эксперименте у неполовозрелых крыс.
В каждой митохондрии имеется механизм, посредством которого восстановленный НАД (НАД-Н, где Н - водород), образовавшийся в цикле трикарбоновых кислот, передает свою пару электронов кислороду. Перенос, однако, не происходит напрямую. Электроны как бы передаются «из рук в руки» и, лишь пройдя цепь переносчиков, присоединяются к кислороду. Все компоненты этой системы, находящиеся в митохондриях, фиксированы в пространстве и сцеплены друг с другом. Такое их состояние облегчает перенос электронов. В цепи переноса электронов на каждую пару электронов, перенесенную от
НАДН на O2, синтезируется 3 молекулы АТФ.
Поскольку от каждой молекулы глюкозы отщепляются и передаются молекулам НАД 12 пар электронов, в общей сложности на каждую молекулу глюкозы образуется 36 молекул АТФ. Этот процесс образования АТФ в ходе окисления называется окислительным фосфорилированием.Оказалось, что в крови степень ингибирования при длительной экспозиции металлами Cu, Zn, Cd, Mn, Pb, Hgодного или обоих редокс потенциалов (НАД/НАДН, НАДФ/НАДФН) крови наибольшая в случае марганца > свинца > ртути, затем убывает Cu>Zn>Cd и начинается с концентрации металлов 5-10-4 М. При этом в отличие от митохондрий печени, например, токсическое действие цинка, меди, свинца и кадмия проявляется уже при концентрации превышающей нормальную в два раза и затем практически остается на этом уровне при увеличении концентрации еще в 5 и 10 раз. Тогда как в печени и почках двукратное увеличение концентрации меди и цинка активирует дыхательную цепь, в крови и легких, происходит ингибирование (рис. 23).
Митохондриальная дыхательная цепь печени очень чувствительна к повышению содержания ртути и марганца, несколько менее кадмия и свинца и оказалась высокорезистентной к увеличению концентрации цинка и меди.
Картина наблюдаемая в суспензии митохондрий легких очень напоминает характерную для крови.
В сердце при высоких дозах токсический эффектов убывает в ряду Pb >Cd>Zn>Hg>Cu>Mn, однако при концентрации всего в два раза превышающую нормальную наиболее выраженное токсическое действие оказывает ртуть, марганец и цинк. Высокая токсичность изученных металлов в действии на основную функцию митохондрий синтез легкодоступного для использования источника энергии АТФ, обусловлена стимулированием тяжелыми металлами утечки протонов (проникновение протонов через мембрану митохондрий как пассивно, так и через изменение стехиометрии протонной помпы), снижая тем самым эффективность окислительного фосфорилирования. Это усугубляется способностью кадмия, ртути, свинца, хрома и некоторых других металлов депонироваться в паренхиматозных органах [Ambrosi l., Lomonte C., Soleo L.
et al., 1990; Knobeloch L.M., Blondin G.A., Lyford S.B. and Harkin J.M., 1990; Passada R., 1983] и медленным выведением из организма. Период полувыведения для кадмия составляет более 10 лет, для свинца - около 30 лет, для хрома - около 1 месяца [Aiyar J., Bercovits H.J., Floyd R.A. et al., 1991;].
Рис 25. Концентрационные зависимости действия тяжелых металллов на дыхательную цепь митохондрий различных органов неполовозрелых крыс.
По оси ординат - изменение интенсивности функционирования дыхательной цепи, по оси ординат концентрация металла, мМ.
1 - Zn, 2 - Си, 3- Pb, 4- Сё, 5- Hg, 6- Mn.
Нарушение функции митохондрий при воздействии ртути, кадмия, свинца, мышьяка, хрома в конечном итоге проявляется снижением продукции макроэргов, уменьшением соотношения НАД/НАДН, НАДФ/НАДФН и как следствие АТФ/АДФ [Argese E., A. Marcomini, P. Miana, C. Bettiol and G. Perin. 1994; Coban T., Beduke Y., Iscan M. 1996; Goyer A., 1990], падением активности АТФ-зависимых ферментных систем, за счет нарушения фосфорилирования фермента [Passada R., 1983]. Таким образом, в основе действия тяжелых металлов лежит ингибирование окисления НАД-зависимых субстратов и возможно цитохром-С-оксидазу [10]. Изменение активности цитохром-Р-450 играет роль в токсическом действии свинца и кадмия [Knobeloch L.M., Blondin G.A., Lyford S.B. and Harkin J.M., 1990, Petering D.H., Fowler B.A., 1986]. Выявляемую при хроническом действии малых доз свинца и ртути копропорфиринурию связывают с блоком
копропорфириногеноксидазы, локализованной в межмембранном пространстве
митохондрий.
В качестве "ловушек" металлов могут выступать специфичные белки, связывающие двухвалентные металлы, такие как металлотионеин (белок с м.м. 6,5 кД, высоким содержанием цистеина (около 30%) и отсутствием в молекуле ароматических аминокислот, синтезируется в печени и почках), связывающий кадмий и цинк, свинец- связывающий белок, трансферрин, церулоплазмин.
Свинец-связывающий протеин имеет м. м. около 27 кД, богат глутаминовой, аспарагиновой аминокислотами, глицином, цистеином и связывает около 40-50 мг свинца на 1 мг [Ambrosi l., Lomonte C., Soleo L. et al. 1990; Coban T., Beduke Y., Iscan M., 1996]. К неспецифичным металл-связывающим белкам относятся сывороточный альбумин, глутатион, мембранные белки базолатеральной и/или апикальной поверхности канальциевого эпителия. Образование внутриклеточного комплекса "металл-протеин" направлено на снижение цитоплазматической концентрации металла и играет антитоксическую роль [Coban T., Beduke Y., Iscan M., 1996; Fowler B.A., 1992]. Механизм действия ксенобиотиков включает и прямое генотоксическое действие (нарушение структуры и процессов репарации ДНК, нестабильность хромосом, хромосомные аберрации), ферментотоксическое (за счет связывания SH-групп ферментов или вытеснения эссенциальных металлов из металлоферментов) и мембранопатологическое действие [Knobeloch L.M., Blondin G.A., Lyford S.B. and Harkin J.M., 1990; Rossi E., Costin K.A.,1990]. Знание патогенетических механизмов цитотоксического действия тяжелых металлов обосновывает использование в профилактике и терапии заболеваний, связанных с хроническим действием ксенобиотиков, антиоксидантов, мембраностабилизаторов, препаратов, улучшающих функцию митохондрий, и блокаторов кальциевых каналов. Экопатогенные факторы, особенно в сочетании с другими причинными агентами, основной внутриклеточной мишенью действия которых является митохондрия, увеличивают риск развития хронических болезней особенно в детском возрасте.2.2.4.