Исследование на трихинеллез, цистицеркоз и шистосомозы
Компрессионный метод выявления личинок трихинелл.
Кусочек двуглавой или икроножной мышцы (вблизи сухожилия), взятой хирургическим путем с соблюдением асептики, расщепляют препаровальными иглами на отдельные тонкие волоконца, сдавливают их между двумя предметными стеклами в капле глицерина так, чтобы препарат был тонким и прозрачным.
Под микроскопом с затемненным полем зрения хорошо видны личинки трихинелл. Эффективно исследование нескольких кусочков мышц в компрессориумах, используемых в ветеринарно-санитарной практике, особенно в специальных трихинеллоскопах.Метод переваривания Берманна: 1 г измельченных мышц заливают 60 мл искусственного желудочного сока (0,5 г пепсина, 0,7 мл концентрированной соляной кислоты, 100 мл воды) и выдерживают 18 ч в термостате при температуре 37 °С; верхний слой жидкости сливают, к осадку добавляют теплой воды (37-45 °С) и выливают в аппарат Берманна. Через 1 ч жидкость спускают в пробирку, центрифугируют и исследуют осадок. Если личинки заключены в обызвествленные капсулы, их предварительно декальцинируют в растворе соляной, азотной или серной кислоты.
Биопроба. Кусочки исследуемых мышц скармливают белым мышам или крысам. Через 2-3 дня можно обнаружить половозрелых трихинелл в дуоденальном содержимом, а через 2-3 недели - их личинки в диафрагме и языке.
Гистологические срезы. Кусочки мышц фиксируют в жидкости Буэна; срезы готовят обычным способом на микротоме и окрашивают их гематоксилином.
Выявление цистицерков. Кусочек экстирпированной мышцы или соединительной ткани осматривают невооруженным глазом, осторожно выделяют цистицерк - беловатый полупрозрачный пузырек размером 1-2 см, раздавливают его между двумя предметными стеклами в капле глицерина и исследуют под микроскопом.
Для определения жизнеспособности выделенных из тканей цистицерков их выдерживают в 50%-ном растворе желчи на изотоническом растворе хлористого натрия в термостате при температуре 37 °С; через 10-60 мин головка жизнеспособного цистицерка выворачивается наружу.
Обызвествленных цистицерков предварительно декальци- нируют 4%-ным раствором азотной кислоты в течение 1 ч.
Выявление яиц шистосом. При хронических формах ши- стосомозов, когда образование гранулем препятствует выходу яиц из тканей в просвет кишечника или в мочевыводящие пути, применяют биопсию слизистой оболочки прямой кишки, которую производят специальной ложкой с помощью ректоскопа, выбирая участок с видимым поражением. Биопсированный кусочек раздавливают между двумя предметными стеклами и исследуют под микроскопом. При отрицательном результате кусочки просветляют в 4%-ном растворе едкой щелочи и готовят из них гистологические срезы.
В ряде случаев мочеполового шистосомоза диагноз может быть поставлен только на основании эндовезикальной биопсии.
При гепатолиенальной форме шистосомоза производят пункционную биопсию печени, из полученного материала готовят гистологические срезы и исследуют их под люминесцентным микроскопом.
При поражении шистосомами женских половых путей выделения собирают с помощью влагалищного зеркала или берут острой ложечкой кусочки слизистой оболочки шейки матки; полученный материал исследуют под микроскопом в капле изотонического раствора хлористого натрия.
Исследование рыбы на зараженность личинками дифил- лоботриид и описторха. При этих исследованиях надлежит руководствоваться тем, что носителями личинок возбудителя дифиллоботриоза являются щука, налим, окунь и ерш, а опи- сторхоза - виды рыб семейства карповых.
Важно также представлять, что плероцеркоиды лентеца широкого локализуются в полости тела, икре, внутренних органах, мышцах рыб, а метацеркарии возбудителя описторхо- за - в подкожном слое мышц не глубже 2-4 мм, преимущественно на спинной стороне.
Обычно исследуют свежевыловленную рыбу. Перед вскрытием ее отмывают от слизи, протирают, взвешивают, измеряют длину. Вскрывают в большой эмалированной кювете или на широкой гладкой доске.
На предмет обнаружения плероцеркоидов тщательно осматривают все внутренние органы и жировую ткань.
Затем приступают к исследованию мускулатуры, разрезая мышцы на пластинки толщиной не более 3-5 мм. И, наконец, выделив плероцеркоиды, изучают их жизнеспособность.С этой целью извлеченные плероцеркоиды помещают в подогретый изотонический раствор хлористого натрия или в искусственный желудочный сок, осторожно раздражая личинок препаровальной иглой. Даже слабые движения личинок свидетельствуют об их жизнеспособности.
Зрелые метацеркарии описторхиса представляют собой цисту овальной формы, внутри которой находится в согнутом состоянии личинка гельминта. Оболочка цисты двойная: наружная - соединительнотканная, образована за счет тканей хозяина; внутренняя - тонкая, сформированная секретом цистогенных клеток паразита. Внутри цисты личинка описторхиса неподвижна, но периодически совершает маятникообразные движения, хорошо заметные при наблюдении под малым увеличением светового микроскопа.
Личинка гельминта имеет ротовую и брюшную присоски. В задней части ее тела расположен экскреторный пузырь, хорошо заметный в виде темного (иногда почти черного) пятна. Передняя часть тела личинки до уровня брюшной присоски, покрыта мелкими шипиками, разглядеть которые не всегда удается даже при большом увеличении микроскопа.
При выявлении жизнеспособности метацеркариев в тканях рыб используют один из двух методов (морфологический и метод определения подвижности личинок).
При использовании первого метода выделенные из тканей рыб метацеркарии переносят в каплю изотонического раствора хлористого натрия на предметное стекло и исследуют вначале под малым, а затем под большим увеличением микроскопа. Признаком гибели личинок является грубое изменение структуры, явное нарушение целости оболочек цист, зернистый распад ее содержимого, разрушение экскреторного пузыря.
Менее выраженные признаки деструкции не могут служить основанием для признания метацеркариев мертвыми. В этих случаях определяют подвижность метацеркариев. Они, в частности, обладают способностью совершать колебательные движения внутри цисты, усиливающиеся при механическом надавливании на них или подогреве.
При провокации двигательной активности метацеркариев используют химические раздражители. На выделенных метацеркариев наслаивают несколько капель дуоденального содержимого или желчи, полученных при зондировании человека, или же 0,5%-ного раствора трипсина, приготовленного на изотоническом растворе. Для ускорения эксцистирования личинок можно осторожно подогреть эти растворы над пламенем спиртовки до 36 °С.
Исследование плодоовощной, плодово-ягодной и растительной продукции на яйца гельминтов и цисты проти- стов. Пробы овощей, плодов, ягод, корнеплодов закладывают в чистые широкогорлые стеклянные банки или эмалированные, пластиковые емкости (типа кастрюль, мисок, кюветов), заполненные водой, объемом 1,5—2,0 л с таким расчетом, чтобы исследуемый материал был полностью погружен в воду и замачивают его на 2 ч. В течение этого времени емкость периодически встряхивают вручную или 5-10 мин в шейкерах (аппараты для встряхивания).
Через 2 ч плоды и овощи обмывают щетками или кисточками, что зависит от их размера, а столовую зелень тщательно прополаскивают. Затем исследуемые плоды, овощи, ягоды или зелень освобождают и промывную воду в течение 1 ч отстаивают.
Надосадочную жидкость осторожно сливают в отдельную емкость и исследуют по методике мембранной фильтрации питьевой и (или) сточной воды в соответствии с МУК 4.2.964-00.
Осадок помещают в центрифужные пробирки, заливают его 3%-ным раствором щелочи (NaOH или KOH) в соотношении 1:2, тщательно перемешивают стеклянными или деревянными палочками и оставляют на 30 мин. Затем центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин и надосадочную жидкость сливают. К осадку в пробирках добавляют один из флотационных растворов (удельный вес 1,38-1,4) в соотношении 1:2 и тщательно перемешивают. Затем пробирки устанавливают в штатив, добавляют в них флотационный раствор до образования выпуклого мениска по краю центрифужной пробирки и накрывают покровным стеклом до соприкосновения с мениском. Оставляют на 20-30 мин. Сняв стеклом пленку, переносят ее на предметное стекло и микроскопируют (окуляр x10, объектив x40).
При исследовании на протистов предметное стекло должно быть смочено 1%-ным раствором Люголя.
Исследование овощей, крупных плодов и бахчевых с отбором проб методом смывов. Для одноименных продуктов берут отдельно пронумерованные центрифужные пробирки. В каждую из них наливают по 4-5 мл 20%-ного раствора глицерина и помещают кисточку, которой многократно и с нажимом производят смыв с поверхности 10-15 экземпляров с таким расчетом, чтобы общая площадь смыва одного и того же продукта составляла 0,5-1,0 м2. При этом после каждого смыва кисточку ополаскивают и отжимают о края пробирки. После смывов кисточки вкладывают в пробирки и доставляют в лабораторию для исследования.
Начинают его с добавления в пробирки с кисточками по 5-6 мл одного из флотационных растворов (с относительной плотностью 1,38-1,4), в котором кисточку многократно и тщательно промывают вертикальными и круговыми движениями. После промывки кисточку отжимают о края пробирки и удаляют. Флотационный раствор добавляют в пробирки до образования выпуклого мениска по краю центрифужной пробирки и накрывают покровным стеклом до соприкосновения с мениском. Оставляют на 20-30 мин. Поверхностную пленку с покровного стекла переносят на предметное стекло. При исследовании на протистов, перед переносом висячей капли на предметное стекло, его смачивают 1%-ным раствором Люголя. Микроскопируют с окуляром x10 и объективом x40. Проводя эти исследования нужно помнить, что соли флотационных растворов при длительном их выдерживании склонны к кристаллизации.
Исследование овощей, столовой зелени, травы на личинки гельминтов. Столовую зелень и другую растительную продукцию исследуют на наличие личинок стронгилоид, анкилостом и других нематод по методу Берманна, а адолескариев трематод по методу Котельникова и Акулина в соответствии с МУК 4.2.796-99.
Наибольшее количество личинок стронгилоид обнаруживают в прикорневой зоне растений. Для дифференциации личинок паразитических нематод от свободноживущих используют метод Корта, который доказал, что свободноживущие нематоды погибают под воздействием формалина быстрее, чем паразитические.
При этом жидкость с личинками помещают в чашку Петри или на часовое стекло. При добавлении к ней 40%-ного раствора формалина в соотношении 1:5 свободноживущие личинки погибают через 5-8 мин, а паразитические остаются живыми в течение 15-20 мин, но подвижность их уменьшается.Исследование на энтеробиоз. Материал для исследования на энтеробиоз получают путем соскобов вокруг ануса. Производят его вечером через 1-1,5 ч после того, как больной лег спать (или утром до туалета), спичкой, срезанной наискось и смоченной изотоническим раствором хлористого натрия или 2%-ным раствором двууглекислой соды. Собранную на конце спички слизь счищают краем покровного стекла в каплю жидкости на предметном стекле, покрывают его покровным стеклом и исследуют под микроскопом. При массовых обследованиях, когда соскобы берут в детских учреждениях, использованную спичку помещают в каплю жидкости на предметном стекле и после ее подсыхания покрывают другим предметным стеклом. Затем, завернув в бумагу и закрепив резинкой, доставляют в лабораторию.
Нередко пациенту на дом выдают пробирку с ватным тампоном, которым он утром протирает перианальные складки и, поместив тампон обратно в пробирку с небольшим количеством воды, приносит в лабораторию. Тампон прополаскивают, центрифугируют жидкость и, получив осадок, исследуют его под микроскопом.
Целлофановый метод Холла. Квадратный кусочек целлофана укрепляют резинкой на стеклянной палочке. Соскоб делают сухим целлофаном и помещают его в пробирку. В лаборатории целлофан слегка сдвигают с палочки и, срезав его кончик ножницами, расправляют на предметном стекле; затем смачивают децинормальным раствором едкого натра, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.
Метод с целлюлозной лентой Грэма. Полоску целлюлозной ленты прижимают клейкой стороной к перианальным складкам обследуемого, затем той же стороной - к предметному стеклу и исследуют без покровного стекла; можно добавлять каплю толуена.
Каледин для этих целей предложил применять целлулоидные диски, вырезанные из отмытой рентгеновской пленки и смоченные глицерином; диски исследуют на предметном стекле в капле силикатного клея.
Подногтевой соскоб. Края ногтя, ногтевое ложе, подногтевые пространства смачивают 0,5-1%-ным раствором едкой щелочи и протирают влажными ватными тампончиками. Отжав их в слабощелочном растворе щелочи, центрифугируют и исследуют осадок.