Стимуляторы каротиногенеза у гриба BI. trispora

Исследования, проведенные и 1950-1960-х годах, позволили обнаружить и выделить соедине

ния, которые образуются при совместном культивировании штаммов BI. trispora и способны к сти муляции синтеза р-каротина в отдельно культивируемых (-) штаммах этого гриба.

Способность к синтезу триспоровых кислот в основном обнаружена у (+) и (-) штаммов гриба В1. trispora (около 100 мг/л) при их совместном культивировании. Остальные мукоровые грибы, нап­ример, Р. blakesleeanus, не способны синтезировать более 1 мг/л триспоровых кислот. Обнаружено, однако, что при совместном культивировании (-) штамма BI. trispora и (+) штамма Cunninghamella japonica, не способного к синтезу каротина, в среду выделяется приблизительно 5—7 мг/л триспо­ровых кислот. Этот факт, а также другие исследования, проведенные ранее, показали, что биосин­тезу триспоровых кислот способствуют взаимодействия специфических предшественников, обра­зуемых отдельно (+) и (-) штаммами BI. trispora. Установлено, что триспорины и 4-гидрокси-мети- лтриспораты стимулируют образование зигофор и биосинтез триспоровых кислот у (+) и (-) штам­мов BI. trispora.

Хотя триспоровые кислоты и вызывают сильный стимулирующий эффект на выход р-каротина, и несмотря на то, что их использование позволило бы осуществлять процесс ферментации только с одним продуцентом — (-) штаммом, на практике этот способ не получил широкого применения из- за высокой стоимости триспоровых кислот и их нестабильности.

В ходе исследований по стимуляции каротиногенеза обнаружено, что существует еще один сти­мулятор синтеза р-каротина у BI.

Обнаружено также, что кроме триспоровых кислот и р-ионона, синтез каротиногенных фермен­тов обеспечивает витамин А (ретинол).

В отличие от триспоровых кислот, р-ионон действует только на фоне добавления растительного масла. Эффект масла связан с присутствием в нем линолевой кислоты. Замена ее на олеиновую сни­жает стимулирующий эффект р-ионона. Известно, что С₁₈-жирные кислоты являются активатора­ми синтеза ряда ферментов и, вероятно, действие р-ионона сочетается с функциями этих фермен­тов. Таким же образом можно объяснить и стимулирующий эффект витамина А, проявляющийся только при введении в среду подсолнечного масла.

Обычно для производстваа р-каротина в качестве стимуляторов применяют такие еще более де­шевые заменители, как: 1,6,6-триметил-1-ацетилциклогексен, лимонен, цитрусовую пульпу или цитрусовое масло. Значительным стимулирующим эффектом обладают ретинол, некоторые арома­тические соединения (диметилфталаты, вератрол) и ряд гетероциклических соединений (изони- азид, ипрониазид). Добавки грибной биомассы, полученной при предыдущих ферментациях, так­же создают стимулирующий эффект.

В качестве стимуляторов каротиногенеза предложены и другие соединения. Отметим, что об­щепринято активаторы синтеза каротина делить на три группы: триспоровые кислоты, соедине­ния, содержащие р-иононовое кольцо (ретинол, р-ионон), и фенилпроизводные, из которых в прак­тике используют диметил фталат и вератрол.

Стимуляторами каротинообразования у BI. trispora являются также некоторые амиды, имиды, лактамы, гидразины, замещенные пиридины, в частности сукцинимид и изоникотиноилгидразин, которые более чем в 3 раза увеличивают выход p-каротина при совместном культивировании (+) и (-) штаммов BI. trispora.

Действие перечисленных выше соединений на каротинообразование обусловлено тем, что эти соединения выступают- как стрессоры, а согласно современным представлениям, совершенно раз­личные по своей природе факторы могут в определенных концентрациях вызывать нарушение го­меостаза и, как следствие, интенсифицировать синтез вторичных метаболитов, в частности р-кароти- на. Существует множество данных, подтверждающих факт интенсификации синтеза каротиноидов неблагоприятными факторами. Например, у водорослей Haematoccocus pluvialis каротиноид астак­сантин синтезируется в условиях голодания и солевого стресса. Образование каротиноидных пигмен­тов у бактерий рода Thermits также происходит под действием стрессового фактора — интенсивного освещения. Однако, этот способ при производственной ферментации связан со значительными затра­тами и удорожанием себестоимости получаемого продукта. Исходя из этого, более приемлемым пре­дставляется способ, в котором воздействию света подвергается только посевной материал.

Очень важной проблемой при производстве каротиноидов является окисление конечного продукта. При искусственном стимулировании биосинтеза каротиноидов не в полной мере син­тезируются соответствующие природные антиоксиданты типа ренолпроизводных соединений. Поэтому существует необходимость введения в среду дополнительных неприродных антиокси­дантов, стабилизирующих каротинсодержащий мицелий. Уже давно для этих целей использу­ется сантохин (б-этокси-1,2-дигидро-2,2',4-три-метилхинолин). Для хранения биомассы стали применять добавки к мицелию сахарозы, карбоксилметилцеллюлозы, крахмала, желатины, при этом стабильный уровень каротина может сохраняться в течение 9—12 мес при температуре не выше 41 °С. Оптимальные условия введения сантохина — через 40—60 ч от начала фермента­ции и за 3-10 ч от начала термической обработки; антиоксидант вводят в количестве 0,05 % .

Несмотря на экологически чистое производство и на перспективу срздания в будущем сверхсинте­тиков каротиноидов путем генной инженерии, основными недостатками микробиологического спосо­ба получения каротиноидов на настоящий момент являются дорогая среда роста, наличие в биотехно­логическом процессе двух штаммов и необходимость достаточно высокой стерильности производства.

Таким образом, в заключение, следует отметить, что любой из способов получения каротино­идов (в частности р-каротина) имеет свои преимущества и недостатки.

В настоящее время ведутся работы, направленные на удешевление и стандартизацию микроби­ологического способа получения каротиноидов с использованием методов генной инженерии, осу­ществляемые в двух направлениях:

1) гены, контролирующие путь биосинтеза определенного каротиноида, должны быть клони­рованы'в организм, способный быстро расти на экологически чистых и дешевых средах;

2) путь биосинтеза каротиноида должен быть так изменен в родительском организме, чтобы превратить его в сверхсинтетика этих пигментов.

Так, например, сообщается о введении в ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae генов из бакте­рии Ervinia uredonova и Er. herbicola, кодирующих биосинтез таких каротиноидов, как р-каротин и ликопин. Помимо этих генов в эти же клетки введены гены, ответственные за синтез фарнезил- дифосфата, как начального субстрата в синтезе каротиноидов из индустриального штамма Saccharomyces cerevisiae. Подобный метод позволяет синтезировать 113 мкг ликопина и 103 мкг p-каротина на г. сухой массы . Но пока эти исследования находятся на стадии академических раз­работок и трудно предсказать, достигнут ли они биотехнологического уровня.

5.3.2.