ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Проблема рака яичников, сегодня состоит не столько в лечении, сколько в своевременной диагностике и профилактике. В онкологии понятие профилактика рассматривается в трех аспектах: первичная профилактика (комплекс мероприятий, направленных на ликвидацию факторов, способствующих развитию рака), вторичная профилактика (комплекс мероприятий, направленных на снижение риска и выявление рака в начальных стадиях), третичная профилактика (комплекс мероприятий, направленных на стабилизацию опухолевого процесса у радикально леченных больных).
Наиболее реальной в настоящее время является вторичная профилактика рака яичников. Ее стратегия строится на применении специфических мероприятий, в частности, соблюдении специальной «противораковой» диеты, способствующей уменьшению риска, коррекции гормонального дисбаланса, реализации репродуктивной функции, санации очагов воспаления, хирургическом устранении доброкачественных опухолей и предраковых состояний. Все эти мероприятия могут играть свою роль на доклинической стадии рака яичников и целиком находятся в компетенции акушеров-гинекологов.
Что касается своевременной диагностики рака яичников, то это одна из главных проблем гинекологии. Несмотря на улучшение диагностических методов, около 80% больных поступают в онкологические учреждения с далеко зашедшими стадиями опухолевого процесса. Основные причины хорошо известны - прежде всего, бессимптомное развитие опухоли и, как следствие, позднее обращение к врачу. При этом практически все больные c III и IV стадией рака яичников не переживают 5-летний период, в то время, как при истинно ранних стадиях рака яичников, выживаемость больных достигает в среднем 50-60%. Немаловажную роль в высокой смертности от рака яичников играет отмеченная в последнее время тенденция к резкому омоложению больных и проявление нетипичных форм злокачественных опухолей.
В настоящее время в целях повышения эффективности ранней диагностики рака яичников применяют комплексный подход, который включает ряд клинических, лабораторных и инструментальных методов исследования, среди которых наиболее часто применяется ультразвуковая и рентгеновская компьютерная томография, радиоизотопное исследование, лапароскопия, определение ассоциированных с опухолью маркеров.
Идентификация специфических для каждой опухоли маркерных белков является одним из наиболее перспективных направлений в их диагностике, представляющая большой интерес не только с практической, но и теоретической точки зрения. Для диагностики злокачественных опухолей яичников были предложены и апробированы в клинических условиях многочисленные ассоциированные с опухолью маркеры, однако, к настоящему времени оказались пригодными к применению лишь некоторые из них. Циркулирующие опухолевые маркеры принято считать обычными протеинами, которые секре- тируются опухолевыми клетками в кровоток. При этом опухолевый маркер должен быть доступным, относительно простым и недорогим, достаточно специфичным для изучаемой опухоли. Кроме того, маркер должен давать четкое соотношение между уровнем и весом (количеством) опухолевых клеток, повышаться при ранних стадиях и рецидивах заболевания.
Данные, полученные за последнее время, свидетельствуют о высокой степени корреляции показателей маркеров и распространенностью опухолевого процесса, что позволяет их использовать для мониторинга и прогноза течения опухолевого процесса. Вместе с тем, несмотря на кажущееся обилие опухолевых маркеров, единственным тестом при раке яичников, отвечающим хотя бы в какой-то степени требованиям клиницистов, остается СА-125. Этот маркер в настоящее время широко используется в диагностике и мониторинге эпителиальных форм новообразований яичников.
Отсутствие клинических симптомов рака яичника на ранних стадиях диктует необходимость проведения специализированного клинического мониторинга «групп риска», к которым, прежде всего, относятся носительницы BRCA-1, BRCA-2, hMLHl, hMLH2 и других генных мутаций, риск развития рака яичников для которых может достигать 100%. В настоящее время молекулярно-генетические методы существенно увеличили шансы предиктивного тестирования на наличие предрасположенности к раку яичников. Для этих целей уже разработаны, как относительно дешевые методы ДНК -диагностики, так и более сложные и дорогие методы уточняющей ДНК-диагностики (тест прямого секвенирования всех кодирующих последовательностей BRC A-1 и BRCA-2 в сочетании с методом детекции мутаций по аномальному белковому продукту гена).
Весьма перспективным является метод биочипов, позволяющий в течение нескольких минут провести тестирование всех известных мутаций в этих генах. Однако для осуществления, как специализированного клинического мониторинг «групп риска», так и массового обследования женского населения необходимо наличие простого, дешевого и надежного диагностического метода.Задачи, связанные с разработкой новых технологий своевременной диагностики и профилактики рака яичников, сегодня приобретают первостепенное значение во всем мире. В настоящее время определены четыре главных стратегических направлений:
1. Разработка скрининговых программ с использованием молекулярногенетических и протеомных методов;
2. Разработка показаний к выполнению профилактических хирургических вмешательств (оофорэктомия);
3. Разработка показаний для использования лекарственных препаратов, в частности, оральных контрацептивов, агонистов гонадных релизинг- гормонов, антиоксидантов и др.
4. Разработка методов генной терапии .
Что же касается нынешнего состояния проблемы, то, к сожалению, приходится констатировать, что с помощью клинического обследования органов женской репродуктивной системы рак яичников удается выявить только в 15% случаев. Такие методы, как КТ, ЯМР, позитронно-эмиссионная томография позволяют с высокой точностью определить объем и распространенность опухолевого процесса, оценить эффективность проводимой терапии и выявить рецидив опухоли, однако эти методы неприемлемы для проведения скрининга из-за своей дороговизны. Наиболее приемлемым методом является лишь сонография, однако и данный метод, являясь высоко чувствительным и специфичным, позволяет установить наличие рака яичников 1-й стадии только в 1,5 - 2% всех наблюдений [Hanaham D., 2000].
Хирургические методы профилактики рака яичников у носительниц патологических генов также не обеспечивают надежной гарантии. Так, Tobacman J.K. еще в 1982 г сообщил, что у 11% женщин, относящихся к группе наследственного риска развития рака яичников, в среднем через 5 лет после выполненной профилактической оофорэктомии развивается канцероматоз брюшины, не отличающийся по морфологической структуре от рака яичников [Tobacman JK, Green MH, Tucker MA et al.
1982]. До сих пор не существует единого мнения, кому и в каком возрасте следует выполнять профилактическую оофорэктомию, поскольку рак яичников редко развивается в возрасте до 45 лет (11 на 100000 женщин в группе риска), а риск развития осложнений, связанных с посткастрационным синдромом, может превышать риск развития рака [ Акуленко Л.В., 2005, Жорданиа К.И. , 2005 ].Интенсивное развитие протеомных технологий открыло новые перспективы для поиска маркеров опухолевых заболеваний. Применение масс- спектрометрии SELDI-TOF в этих целях началось около десяти лет назад и сразу дало многообещающие результаты [Petricoin et al, 2002; Kozak et al, 2003]. Некоторые исследователи продемонстрировали точность диагностики с помощью этого метода, близкую к 100% [Zhu et al, 2003]. Однако плохая воспроизводимость результатов в разных лабораториях вызывает сомнения в возможности внедрения этого метода в практическую медицину.
Среди белков-кандидатов на маркер рака яичников особое место занимает сывороточный амилоид А острой фазы (A-SAA), идентифицированный в лаборатории диагностической протеомики ГУ НИИ БМХ РАМН в 2004 [Власова М.А., Макаров О.В., и др., 2005 ]. Способность A-SAA стимулировать пролиферацию клеток, ингибировать апоптоз, а также стимулировать ангиогенез была четко продемонстрирована у больных ревматоидным артритом [Lee et al, 2006]. Именно эти свойства A-SAA явились теоретической предпосылкой для выбора именно этого белка в качестве маркера-кандидата рака яичников в сочетании с классическим маркером СА125 в нашем исследовании.
По результатам нашего исследования A-SAA действительно оказался маркером рака яичников при критической его концентрации в сыворотке крови 0,3 г/л (что соответствует 2,6x10-5 М). Такие концентрации были определены у 17 из 34 больных раком яичников в нашей выборке, т.е. чувствительность A-SAA, как маркера рака яичников самого по себе, составила 50%. У 54 из 56 женщин, не страдавших раком яичников, концентрации A-SAA не достигали критического значения.
Эти данные означают, что специфичность A-SAA, как маркера рака яичников, составляет 96,4%. Таким образом, полученные нами данные позволяют утверждать, что чувствительность масс-спектрометрического определения A-SAA в сыворотке лежит в пределах концентраций 0,2-0,3 г/л (1,7-2,6x10-5 М).
Нам удалось установить, что увеличение на два-три порядка концентрации A-SAA при раке яичников не связано со стадией опухолевого процесса. Вместе с тем, у 2 из 14 пациенток с доброкачественными опухолями яичника концентрации A-SAA в сыворотке крови достигали критического значения (34 г/л). Обе эти пациентки страдали серозной цистаденомой. Полученные данные не исключают констатацию начальных стадий канцерогенеза у этих пациенток с помощью масс-спектрометрической детекции A-SAA.
Кроме того, в наше исследование были включены пациентки с миомой матки. Как известно, концентрация СА125 у пациенток, страдающих миомой матки, часто немного превышает критический уровень (38-40 единиц). Нам же удалось продемонстрировать, что концентрация A-SAA в сыворотке крови у всех пациенток с миомой матки является очень низкой, что позволяет предположить о возможности использования этого маркера для дифференциальной диагностики патологии органов малого таза у женщин.
Следует отметить, что критический уровень A-SAA, определяемый с помощью масс-спектрометрии SELDI-TOF, очень близок критическому уровню этого белка для ряда воспалительных заболеваний [Casl et al, 1995; Casl et al, 1996], что дает основания для использования прямого масс- спектрометрического профилирования для быстрого определения повышенного уровня A-SAA в сыворотке крови.
Хотя масс-спектрометрическое определение масс методом SELDI-TOF- MS обладает невысокой точностью, тем не менее, погрешность в определении массы A-SAA в нашем исследовании не превышала 3-5 Да, что позволило различить различные формы A-SAA в сыворотках крови с содержанием A-SAA более 0,3 г/л. Возможность наблюдать различные формы одних и тех же белков является важным преимуществом масс-спектрометрических методов по сравнению с иммунологическими методами детекции белков.
Судя по полученным данным, основными аллелями А-SAA в исследуемой нами выборке являются SAA1a и SAA2a. Поскольку мы определяли А- SAA в цельных сыворотках крови и только в сыворотках с резко повышенным уровнем А-SAA, полученные нами данные носят оценочный характер.
Для математической обработки полученных данных мы использовали классификатор TSP, который был предложен для обработки данных ДНК- микрочипов и идентификации генов-маркеров [Xu et al, 2005]. Этот алгоритм классифицирует образцы на основе разностей интенсивностей пиков, а не абсолютных значений интенсивностей, отбирая одну или несколько (k-TSP) пар маркеров с наибольшей разницей интенсивностей. Применение TSP- классификатора позволило выявить только одну пару с наибольшим счетом, состоящую из интенсивностей пиков 11681 Да и 13769Да. В случае если разность интенсивностей указанных пиков положительна, исследуемый образец классифицировался как «рак яичников», если отрицательна, то как «отсутствие рака яичников».
Несмотря на то, что процент правильной классификации с применением TSP составила всего 79,9%, биологический смысл полученных результатов легко интерпретировать. Оба пика выбранной пары соответствовали известным маркерам рака яичника. Пик с m/z 11681 Да соответствовал основной форме A-SAA [Moshkovskii et al, 2005], концентрация которого при раке яичника повышается, а пик с m/z около 13769Да соответствовал нативной форме транстиретина, концентрация которого при раке яичника понижается [Gericke et al, 2005]. Таким образом, (k-)TSP классификатор заслуживает внимания как один из способов обработки данных протеомных исследований с целью выявления биомаркеров. Пара биомаркеров, отобранная в нашем исследовании (А- SAA-TTR), представляет собой новую бинарную переменную (разность интенсивностей, принимающую положительные или отрицательные значения), которую оказалось возможным комбинировать с данными иммуноферментного анализа для улучшения классификации.
В нашем исследовании для разработки диагностических алгоритмов с применением методов SVM и LR были использованы различные комбинации данных. Цель проверки различных комбинаций данных заключалась в определении оптимального набора признаков для распознавания рака яичников. Диагностический алгоритм разрабатывали на основе:
1) значений концентраций только классического маркера рака яичников CA125, измеренных методом ИФА;
2) комбинации значений концентраций CA125 и А-SAA, измеренных методом ИФА;
3) данных только масс-спектрометрии (значений интенсивностей 48 SELDI-MS m/z пиков);
4) комбинации значений концентраций CA125 и A-SAA, измеренных методом ИФА и масс-спектрометрических данных (значений интенсивностей 48 SELDI-MS m/z пиков);
5) значений концентраций CA125 и A-SAA, измеренных методом ИФА в комбинации с бинарной переменной, полученной после применения TSP анализа и представляющей собой формализованные данные масс- спектрометрии.
Эффективность диагностических алгоритмов, полученных на основе тестируемых 5 вариантов данных с помощью SVM и LR-классификаторов, была оценена путем перекрестной проверки на достоверность. Оказалось, что добавление значений концентраций А-SAA к значениям концентраций CA125, измеренных методом ИФА, не приводит к повышению точности классификации. При работе с данными только масс-спектрометрии, метод SVM дал лучшие результаты, чем метод LR и точность SVM для данных масс- спектрометрии была значительно выше, чем при использовании только значений концентрации CA125 (89,5% против 86,1%). LR-классификатор, напротив, дал существенно лучшие результаты, чем SVM при обработке бинарных данных TSP в комбинации с данными ИФА, причем данные TSP существенно повысили точность классификации (90,7% против 85-86% только для CA125).
Наилучшей точности распознавания (95,2%) рака яичников, доброкачественных опухолей яичников, миомы матки и отсутствия патологии органов малого таза удалось достичь путем SVM обработки комбинированных данных ИФА и масс-спектрометрии. Так, рак яичников был правильно распознан на любой стадии опухолевого процесса. А рак яичников I-II стадии был правильно распознан у 57,1% больных. Практически все сыворотки крови больных миомой матки были распознаны правильно. Средний процент ошибок в группе больных миомой матки оказался даже ниже такового в группе здоровых женщин.
До настоящего времени масс-спектрометрический анализ с применением технологии SELDI-TOF считался эмпирическим методом. Систематические исследования по аннотированию масс-спектрометрических профилей сыворотки крови не проводились. Мы впервые предприняли попытку сопоставления наблюдаемых масс-спектрометрических пиков с известными компонентами сыворотки крови. С этой целью нами был проведен кластерный анализ данных с целью выявления групп взаимосвязанных белков. Благодаря полученным нами данным, масс-спектрометрический анализ сыворотки крови получил перспективу развиваться, как полуколичественный экспресс-метод.
Нами установлено, что несколько из дискриминаторных пиков соответствуют разным формам сывороточного амилоида. Так, дискриминаторный пик 11681 Да, соответствующий мажорной форме сывороточного амилоида А (SAAla), присутствовал среди дискриминаторных пиков, полученных как методом логистической регрессии, так и SVM при использовании масс- спектрометических данных и отсутствовал при добавлении к ним данных ИФА. Это объясняется тем, что интенсивность масс-спектрометрического сигнала коррелирует с концентрацией А-SAA в сыворотке, а при добавлении данных ИФА масс-спектрометрические данные об уровне данного маркера в крови оказываются избыточными.
При использовании комбинированных данных иммуноферментного анализа и масс-спектрометрии в качестве маркеров-кандидатов рака яичников были отобраны другие формы A-SAA (например, форма с m/z 11728 Да).
Среди дискриминаторных пиков присутствовали пики, соответствующие нативной и цистеинилированной формам транстиретина, причем пик цистеини- лированной формы был отобран всеми четырьмя классификаторами. Хотя комбинация значений концентраций А-SAA и СА125, измеренных методом ИФА, не привела к повышению точности диагностики, среди дискриминаторных масс-спектрометрических пиков присутствовали несколько форм А-SAA. Эти данные свидетельствуют о том, что соотношение различных модификаций маркеров вносит вклад в повышение эффективности диагностики рака яичников.
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что используя масс-спектрометрическую технологию SELDI-TOF можно с достаточно высокой эффективностью распознавать сыворотки крови больных раком яичников, здоровых женщин и больных доброкачественными опухолями яичников и миомой матки.