Экспериментальная часть
Исходя из поставленных задач, нами создана модель ФнК (кистозных яичников с преобладанием ФК)[1], модель ЭХЛ ФнК в режиме монополярной коагуляции, проведено изучение морфофункционального состояния яичников, исследованы половые гормоны в периферической крови при экспериментальных кистозных образованиях и их ЭХЛ.
В литературе имеется значительное количество сведений о возможности возникновения кистозных образований яичников у различных видов млекопитающих в результате самых разнообразных воздействий (339). ФК встречаются у крупного рогатого скота [226], свиней [227], собак [161], кроликов [281], крыс [304], кобыл [269], овец [180] и женщин.
В качестве экспериментального материала в данном исследовании были выбраны половозрелые беспородные белые крысы-самки массой 180-220 г. Закономерности регуляции овариально-менструального цикла у них наиболее близки к таковым у женщин и в отличие от других животных происходит спонтанная овуляция. Кроме того, крысы-самки имеют короткий эстральный цикл (около 5 дней) [273], обусловливающий возможность изучения состояния яичников в динамике в течение короткого срока.
Создание модели кистозных образований яичников было необходимо для приближения патоморфологических изменений и патогенетических особенностей (условий формирования) ФК в эксперименте к таковым в клинике, а также сокращения сроков моделирования, повышения стабильносгн воспроизведения.
Прототипом модели ФнК послужила методика, предложенная К. Bogovich,
J. Clemons, L. Poretsky (1992, 1999) [169]. В одной из серий экспериментов авторы прототипа использовали крыс-самок в возрасте 85 дней, которым вводили субовуляторную дозу человеческого хорионического гонадотропина (ХГ) (1,5-6 ME) дважды в день и дозу инсулина, способную вызвать гипсринсулииемию (1,5-9 ЕД в сутки) в течение 22 дней. Двусторонние поликистозные яичники выявлялись на 23 день эксперимента, преобладали ФК.
Частота образования кист колебалась в пределах 64-80%. Высказано предположение, что в формировании ФК яичников у женщин имеет значение кратковременная гиперстимуляция тека-клеток суперовуляторными концентрациями лютеинизирующего гормона (ЛГ), и в экспериментах in vivo доказана парадоксальная способность предельной гиперинсулинемии уменьшать индукцию овариальных кист ХГ.Нами разработана новая методика воспроизведения кистозных образований яичников (патент на изобретение № 2282249 от 20.08.06. «Способ моделирования поликистозных яичников с преобладанием фолликулярных кисг») [ 131 ][2].
Способ осуществляли следующим образом. При помощи инсулинового шприца внутримышечно в ягодичную область, исключая ранение магистральных сосудов и нервных пучков, вводили 300 ЕД (суперовуляторная доза) ХГ (производитель - ФГУП “Московский эндокринный завод”), разведённого 0,3 мл раствора для инъекций, приложенного к ампуле XI". Аналогичным образом вводили 2,5 ЕД протафана НМ (инсулин; производитель Ново Нордиск, Дания) - дозу необходимую для достижения умеренной гиперинсулинемии, препарат разводили 0,05 мл воды для инъекций. Растворы приготавливали ex tempore. Указанные препараты вводили ежедневно в течение 7 дней в первой половине дня до 12 часов. Подбор доз осуществляли
0,9 % NaCl. Операционное поле широко и тщательно выбривали, кожу обрабатывали спиртом и 5 % йодной настойкой. Производили срединную минилапаротомию, длина разреза не превышала 10 мм. Маточные рога с помощью инструментов для производства микрохирургических операций выводили в рану и обкладывали стерильными марлевыми салфетками, увлажнёнными 0,9 % NaCl. Монополярным игольчатым электродом проводили электрокоагуляцию 2-4 кист яичников на глубину 1,5-2 мм по ограничителю. Коагуляция всех кист могла привести к массивному некрозу яичника, что следует учитывать при оценке морфологических изменений и проведении морфоколичественного анализа. Время экспозиции - 1 секунда. Мощность коагуляции и время экспозиции подобраны с учётом объёма, типа ткани и необходимой глубины воздействия, согласно рекомендациям разработчиков.
Операционную рану ушивали послойно (брюшину и мышцы вместе с использованием полидиоксанона, на кожу отдельные шёлковые швы), обрабатывали раствором йодинола. Необходимо отметить, что в связи с резким полнокровием сосудов в ходе моделирования ФнК, о чём будет сказано в главе результатов исследования, при коагуляции кистозных образований у 3-х животных возникло кровотечение, требовавшее дополнительной коагуляции; ушивания яичника не потребовалось ни в одном случае.Оперативное вмешательство проводили в соответствии с принципами безопасности в эяеюрохирургии [4]. Длительность операции составляла 8-10 минут. При выполнении лапаротомии стремились приблизить эксперимент к эндоскопическим операциям при кистах яичников в клинике: минилапаротомнческий доступ с минимальной кровоногерей и травматизацией, предотвращение высушивания тканей незначительными мощностью коагуляции и временем экспозиции, коагуляция исключительно кист без прилежащей яичниковой ткани, безопасный шовный материал.
Эксперименты выполнены на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии (заведующий - профессор С.В. Логвинов), на базе отдела нормальной физиологии и экспериментальной хирургии центральной научно
эмпирическим путём с учётом видовых особенностей экспериментальных животных и известных эффектов препаратов на яичники. Эксперименты осуществляли в фазы покоя астрального цикла.
Всем животным проводили кольпоцитологическое исследование для определения стадии астрального цикла и эстрогенной насыщенности организма. Оценку производили по содержанию эпителиальных клеток, содержащих ядра, ороговевших (поверхностных) клеток и лейкоцитов. Проэсгрус, эсзрус, метаэструс и диэсчрус у крыс соответствуют дссквамации, регенерации, пролиферации и фазе секреции у женщины. Влагалищные мазки у крыс брали ежедневно путём смыва содержимого влагалища дистиллированной водой из пипетки на предметное стекло с последующей окраской водным раствором метиленовой сини.
Следует отметить относительную простоту воспроизведения модели, приближенность к клинике, стабильность получаемых данных и отсутствие летальных исходов у экспериментальных животных, что позволяет расширить область применения данного способа.
За основу модели электрохнрургического лечения кист яичников была взята методика монополярной коагуляции яичников, предложенная И.Ю. Бухариной (2003). Для коагуляции использовали аппарат электрохирургический высокочастотный С-350 РЧ “Электропульс” (г. Томск, регистрационный номер: 42/99-1038-1411; сергификат соответствия №РОСС RU.MLE41 .В02148). Воздействие на кистозные образования яичников производили в режиме монополярной коагуляции мощностью 60 Вт с использованием игольчатого электрода диаметром 1 мм. Выбор режима обусловлен особенностями проведения эксперимента - небольшими размерами кист, и широким использованием монополярного тока при операциях на
яичниках.
Оперативное вмешательство проводили в асептических условиях под масочным наркозом парами эфира. Животных фиксировали в положении на спине на нейтральном электроде, равномерно обернутом марлей, смоченной
исследовательской либоратории (ЦНИЛ) (заведующий - профессор А Н. Байков) СибГМУ.
Животных содержали в стандартных условиях на базе вивария ЦНИЛ СибГМУ в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). В каждую клетку были помещены 5 крыс. Крысы находились при дозированном освещении (12:12 часов, свет в дневные часы) с контролируемым температурным режимом [106, 212, 237, 246], на брикетном питании (гранулированный корм ГТК-120-3, зерно пшеницы и овса) с добавлением овощей и творога, имели свободный доступ к воде и пище. Крыс, полученных в центральном виварии СибГМУ, вводили в эксперимент только через 1-2 недели (карантин) [193]. Экспериментальные воздействия осуществляли в осеннее зимний период для исключения влияния сезонных колебаний. Ежедневно всех животных осматривали, отмечали их общее состояние, внешний вид, поведение, регистрировали двигательную акгивность и пищевую возбудимость, массу тела измеряли на медицинских весах.
После проведения оперативного вмешательства контролировали состояние микролапаротомных швов, отмечали выраженность симптомов раздражения брюшины.При аутопсии визуально оценивали состояние органов брюшной полости: наличие и характер выпота, состояние брюшины, измеряли размеры, объем яичников, отмечали характер структуры коркового слоя, наличие фолликулов, кистозных образований, кровоизлияний. Отработанный биологический материал утилизировали в специальные контейнеры через ЦНИЛ СибГМУ.
Проведено 2 серии опытов на 90 животных. Крысам основной группы (п=36) проводили монополярную коагуляцию кистозных образований яичников. Группу сравнения (п=36) составили животные с моделью ФнК (не подвергавшиеся оперативному вмешательству). С целью изучения физиологических возрастных процессов, происходящих за 60 суток
наблюдения, исследовали яичники интактных крыс (контрольная группа; п=18). Интактные животные содержались с экспериментальными в идентичных условиях вивария.
Крыс выводили из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом в различные сроки опыта одновременно с контрольной группой. Дизайн исследования представлен на рис. 1.
Проведённые исследования отвечали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Министерства здравоохранения СССР №755 от 12.08.1987 г) и Федеральному Закону Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г.
Эксперимент соответствовал требованиям этической экспертизы, протоколы локального этического комитета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава № 15 от 26.01.2004 г. и № 514 от 27.И .2006 г.
2.1.1.