ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом морфологического (гистологического и цитологического) исследования являлись гастробиоптаты слизистой оболочки антрального отдела желудка, полученные во время фиброгастроскопического исследования 435 больных ХГ, ассоциированным с Нр, обследованных в диагностическом центре Челябинской областной клинической больницы в период с 2003 по 2006 гг.

Эндоскопические исследования проводились с помощью фиброгастродуоденоскопов JF-B2 и GJF-K2 фирмы “Olympus”. Во внимание принимались пол, возраст больных, анамнез заболевания. Эндоскопическая характеристика состояния слизистой оболочки желудка больных хроническим гастритом чаще всего характеризовалась различной степенью гиперемии, отека, разрыхления слизистой, состоянием складок ее и особенностями сосудистого рисунка, наличием или отсутствием дефектов, кровоизлияний и образований СОЖ.

Из-за невозможности получения и сохранения серии мазков- отпечатков от каждого больного для различных цитологических исследований, материал для последнего набирался последовательно по группам, исходя из поставленных задач (рис. 2.1).

1. Гастробиоптаты и мазки-отпечатки антрального отдела желудка от 224 больных хроническим Нр-ассоциированным гастритом (сплошная выборка), обследованных в 2003-2005 гг. Из них 43 больных (группа экс- Нр-хронический гастрит) обследованы повторно для контроля эрадикации хеликобактерий в период времени от 6 месяцев до 1,5 лет.

Мазки-отпечатки с биоптатов приготавливали путем «прокатывания» кусочка, по стеклу с соблюдением общепринятых правил. Фиксировали и окрашивали по Паппенгейму (гематологический набор фирмы «Абрис+»: быстрый фиксатор-краситель Май-Грюнвальд, фосфатный буфер,

всего 435 больных ХГ, ассоциированным сНр

Л

распределяли на группы по признакам ХГ.

т

99 больных - цитологическое выявление км

г 224 больных - традиционное гистологическое и цитологичес­кое исследование

1 гр -306-х ХГ 2гр -13 6-хФГ 3 гр. - 8 6-х ГП

1 гр - 46 6-х с ПКМ

2 Гр - 40 6-х с НКМ Згр- 13 6-х без ХМ

У Ч

51 больной- исследование ядрышковых организаторов

61 больной - исследование катионных белков тканевых НГ СОЖ

1гр -15 неактивный ХГ 2 гр - 5 малоакт-ный ХГ Згр. - 11 умер акт. ХГ 4 гр. - высок акт ХГ

У Ч

Рис 2,1. Группы больных, набранных последовательно, в зависимости от задач исследования

промывочный раствор на метаноле) в аппарате для окраски цитологических и гематологических мазков ПОМК-1. Приготовление цитологических препаратов к исследованию после их доставки составляло не более 15 минут.

Гастробиоптаты фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали парафином. Парафиновые срезы деиарафинировали, проводили по стандартным методикам и окрашивали гематоксилином и эозином, использовали ШИК-реакцию в сочетании с альциановым синим, а также окраску 0,1% метиленовым голубым на 0,1% растворе натрия тетрабората.

Признаки хронического гастрита на парафиновых срезах гастробиоптатов и параллельных мазках-отпечатках антрального отдела СОЖ оценивали по визуально-аналоговой шкале Сиднейской системы (1994). Результаты цитологических исследований верифицировали, используя гистологические в качестве «золотого стандарта».

Обзорное морфологическое исследование серийных гистологических срезов толщиной 5-7 мкм проводили с помощью объектива * 10, оценивали состояние и соотношение эпителиальною и стромального компонентов. Детализацию и уточнение морфологии структур - *40, *100 (последнее с использованием иммерсионной системы).

Обзорное исследование мазков-отпечатков проводили при традиционно используемом объективе хЮ, Соотношение эпителиального компонента и элементов воспалительного инфильтрата оценивали полуколичественно. Детализация морфологии клеток и бактериальной обсемененности - с использованием объектива *100 и иммерсионной системы.

Степень активности в мазках-отпечатках определяли по полуколичественной оценке наличия нейтрофильных гранулоцитов и сравнивали с таковой в гистопрепаратах, выраженность хронического воспаления - по количеству и плотности лимфоцитов и плазмоцитов. В

оценке состояния эпителия учитывали дистрофические изменения, наличие/отсутствие призматического эпителия кишечного типа, признаков пролиферации эпителиоцитов. Оценку степени бактериальной обсемененности проводили по модифицированной (приспособленной к цитологическому материалу) методике Л. И. Аруина и соавт. (1988): определяли се как слабую при обнаружении до 20 микробных тел в поле зрения, как умеренную - до 50 микроорганизмов, более 50 хеликобактерий в поле зрения при увеличении *1000 расценивали как выраженную обсемененность (гист. - метиленовый синий).

Для определения взаимосвязи признаков ХГ, различий между сравниваемыми группами, вычисляли значение хи-квадрат (отсутствие диагностических различий учитывали при р>0,05; их наличие - при р-препаратам лишь в 43,8%, при достоверном наличии этого признака в традиционных мазках-отпечатках. Отмечалась некоторая зависимость увеличения информативности от повышения активности воспалительного процесса, что, по-видимому,

можно объяснить ослаблением межклеточных связей и более легким попаданием клеток в жидкую среду и в препарат. Результаты расчетов чувствительности специальных методик приготовления монослойных цитологических препаратов в зависимости от активности воспалительного процесса представлены в таблице 2.1.

Таблица 2.1

Зависимость чувствительности методики в определении признаков хронического Нр-ассоциированного гастрита от степени его активности

Монослойные препараты, приготовленные при помощи «Cytospin» и «CcllPrint», оказались пригодными лишь для качественной оценки отдельных признаков хронического гастрита - его активности и метаплазии эпителия. Более целесообразно приготавливать несколько традиционных мазков-огпечатков с гастробиоптата.

3. Для уточнения возможностей цитологического метода в определении полной КМ набрана группа из 99 больных, у которых гастробиоптаты получены прицельно при проведении хромогастроскопии. С биоптатов готовили по 2 мазка-отпечатка для цитологического исследования. Один из них фиксировали и окрашивали по Паппенгейму, другой - фиксировали в 10%-ом забуференном формалине и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Биоптаты проводили и окрашивали по традиционным гистологическим методикам.

Выделено 3 подгруппы: 1) в 46 случаях (46,5%) - наличие полной кишечной метаплазии, 2) в 40 случаях (40,4%) - неполной кишечной метаплазии, 3) у 13 больных (13,1%) отсутствие кишечной метаплазии.

4. Для оценки пролиферативной активности эпителия СОЖ при ХГ исследовали гастробиоптаты антрального отдела желудка 51 больного, полученные прицельно при проведении прямого хромогастроскопического

исследования с наиболее интенсивно окрашенных метиленовым синим участков. В анализе материала динамического наблюдения использованы протоколы эндоскопических исследований 2002-2006 гг.

После приготовления по 2 мазка-отпечатка с биоптата, последние фиксировали, проводили и окрашивали по стандартным гистологическим методикам. Для цитохимической реакции готовили навески нитрата серебра по 120 мг; 2%-й раствор желатины (25мл) с 25мкл муравьиной кислотой (хранится in vitra nigra). Депарафинированные (2 ксилола, 2 спирта, 2 дистиллированные воды) до воды влажные срезы заливали свежеприготовленным 50%-м коллоидным раствором азотнокислого серебра (непосредственно перед употреблением: навеска серебра + 0,25мл дистиллированной воды + 0,125мкл раствора желатины с муравьиной кислотой) на 20-25 минут с помещением во влажную камеру в темное место. Один из мазков- отпечатков окрашивали по Паппенгейму, другой - фиксировали метанолом, затем после импрегнации раствором азотнокислого серебра в течение 40 минут с соблюдением вышеуказанных условий, докрашивали водным раствором толуидинового синего до 3 минут, что позволило кроме оценки ОЯОР провести анализ признаков гастрита согласно требованиям Сиднейской системы (1994).

После традиционного исследования гастробиоптатов 51 больного выделены группы: 30 больных хроническим Нр-гастритом, 13 - фовеолярной гиперплазией (ФГ), 8 - гиперпластическим полипом (ГП). Результаты цитологических исследований верифицированы гистологическими.

Интенсивность экспрессии аргентаффинных ОЯОР оценивали по количеству образующихся гранул серебра по J. Crocker (1989): нуклеолярных (эпителиоциты 1-го типа), диспергированных по ядру эпителиоциты 2-го типа) и их суммарное количество. Подсчет проводился в 100 клетках на препарат под иммерсией с использованием

объектива xlOO. Рассчитывали среднее количество эпителиоцитов 1-го и 2-го типа на 100 клеток, среднее количество нуклеол на ядро клетки в каждом случае. Стандартная статистическая обработка материала проводилась по критерию хи-квадрат и гамма-коррсляций. Статистический анализ ОЯОР - методом вариационной статистики с определением непараметрических тестов: показатели достоверности межгруииовых различий - по критерию Краскел-Уоллиса; по критерию Манна-Уитни (при отсутствии обозначений), с учетом поправки Бонферрони для числа множественных сравнений равного 6 (пороговое значение р=0,008), для числа множественных сравнений равного 3 (пороговое значение р^0,017); по критерию Колмогорова-Смирнова (К-S); по медианному критерию (М); а также по парному критерию Вилкоксона.

5. При изучении морфо-функционального состояния тканевых нейтрофильных гранулоцитов при Нр-ассоциированном ХГ исследовали гастробиопсийный и цитологический материал антрального отдела желудка от 61 больного. С гастробиоптатов приготавливали цитологические мазки-отпечатки, фиксировали их 3-5 минут в метаноле, окрашивали спиртовым раствором прочного зеленого в течение 20 минут методика Spilznagel (1963) в модификации В.Е. Пигаревского (1978), докрашивали толуидиновым синим (насыщенный водный раствор вызревал сутки, добавляли 10 мл 96% спирта, рабочий раствор готовили разбавлением основного буфером в 30 раз). Гастробиоптаты приготавливали, проводили и окрашивали по стандартным методикам. Гистологические проявления ХГ градуировали с помощью визуально­аналоговой шкалы Сиднейской системы (1994) и сопоставляли их с таковыми в мазках-отпечатках. При цитохимическом светооптическом исследовании использовали принцип Astaldi (1957), оценивали процентное содержание «положительно» реагировавших нейтрофилов, вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК) по L. Kaplow (1955). К «нулевому» типу относили клетки без гранул. К 1-му (а) типу

относили клетки низкой степени активности, содержащие единичные гранулы (до 25% площади цитоплазмы заполнено гранулами), т.е. значительно декатионизированные (по Пигаревскому). Ко 2-му (б) - средней степени активности клетки с площадью цитоплазмы на 30-70% заполненную гранулами (частично декатионизированные). К 3-му (с) высокой степени активности - на 70-100% . Для определения СЦК в мазке подсчитывали 100 клеток (ІЇГ) и определяли его по формуле: СЦК=а*2б