Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на обнаружении иммунного комплекса, один из компонентов которого (антитело или антиген) мечен ферментом, способным разлагать субстрат (хромоген) с образованием окрашенных продуктов.

В настоящее время применяется только твердофазная модификация ИФА, пользуясь которой антитела или антигены сорбируются в лунках полистироловых планшетов (на твердой фазе). В большинстве случаев к твердой фазе присоединяются антитела, которые при инкубации с материалом улавливают специфический антиген в ближайшие 30 мин. К образовавшемуся при этом иммунному комплексу затем еще на 30 мин прибавляются меченные пероксидазой антитела, специфические то ли к его антигену, то ли к его антителу.

В итоге образуется иммунопероксидазный тройной комплекс, при добавлении к которому ортофенилендиамина с Н2О2 как хромогенного субстрата для пероксидазы через 10 мин происходит пожелтение. Результаты твердофазной модификации ИФА учитываются с помощью специального спектрофотометра.

Иммуноблотинг. В основе иммуноблотинга (blot - пятно) лежит идентификация антигенов и антител на пленке-носителе с помощью ИФА. Его используют, например, в диагностике ВИЧ-инфекции, разделяя белки вируса иммунодефицита человека методом электрофореза в полиакриловом геле. Вслед за этим на полосы преципитата в геле накладывают нитроцеллюлозную пленку и, продолжая электрофорез, переносят белки на нее. Затем пленку смачивают исследуемой сывороткой, а после инкубирования и отмывания от несвязавшихся антител, наносят на нее меченную пероксидазой антисыворотку к Ig человека и ортофенилендиамин как хромогенный субстрат. При образовании комплексов Аг+Ат+антисыворотка на пленке появляются окрашенные пятна.